Patente nacional por "CEPAS MUTANTES DE WEISSELLA CIBARIA PARA LA SOBREPRODUCCIÓN DE RIBOFLAVINA Y DEXTRANO"

Reivindicaciones:
+ ES-2955258_A11. Una cepa bacteriana de Weissella cibaría parental caracterizada por que comprende al menos una mutación en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina, donde dicha región reguladora comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 6, y donde dicha cepa mutada es sobreproductora de riboflavina y dextrano. 2. La cepa según la reivindicación 1 donde la cepa de Weissella cibaria parental se selecciona de entre las cepas con número de depósito: CECT 30583, CECT 30584 y CECT 30585. 3. La cepa según la reivindicación 1 o 2 donde la mutación en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina se selecciona de entre: (a) T en lugar de G en la posición 35 de la SEQ ID NO: 6; (b) T en lugar de C en la posición 43 de la SEQ ID NO: 6; o (c) A en lugar de G en la posición 129 de la SEQ ID NO: 6. 4. La cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicha cepa es la cepa de Weissella cibaria parental con número de depósito CECT 30583 caracterizada porque comprende la mutación T en lugar de G en la posición 35 de la SEQ ID NO: 6. 5. La cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicha cepa es la cepa de Weissella cibaria parental con número de depósito CECT 30584 caracterizada porque comprende la mutación T en lugar de C en la posición 43 de la SEQ ID NO: 6. 6. La cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde dicha cepa es la cepa de Weissella cibaria parental con número de depósito CECT 30585 caracterizada porque comprende la mutación A en lugar de G en la posición 129 de la SEQ ID NO: 6.7 7. Una población bacteriana que comprende la cepa según una cualquiera de las eivindicaciones 1 a 6. 8. Una composición que comprende la cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la población bacteriana según la reivindicación 7. 9. La composición según la reivindicación 8 donde dicha composición es una composición alimentaria. 10. La composición según la reivindicación 8 o 9 que además comprende al menos un aditivo, preferiblemente un aditivo alimentario. 11. La composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 donde dicha composición comprende una concentración de la cepa de entre 107 y 1010 unidades formadoras de colonia (UFC) por gramo o mililitro de composición final. 12. Uso de la cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la población bacteriana según la reivindicación 7 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la producción de dextrano y riboflavina. 13. Uso de la cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la población bacteriana según la reivindicación 7 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 para la producción de alimentos fermentados enriquecidos en dextrano y riboflavina, preferiblemente masas harineras fermentadas. 14. Método para la producción de dextrano y riboflavina que comprende: (i) cultivar la cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la población bacteriana según la reivindicación 7 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en un medio de cultivo que comprende suplementación con sacarosa, y (ii) recuperar del medio de cultivo el dextrano y la riboflavina obtenidos en (i) . 15. Método según la reivindicación 14 donde la etapa (i) se lleva a cabo durante 12 a 48 horas y a una temperatura entre 15 °C y 45 °C. 16. Método según la reivindicación 15 donde la etapa (i) se lleva a cabo durante 15 35 horas, preferiblemente durante 23 horas. 17. Método según la reivindicación 15 donde la etapa (i) se lleva a cabo a una temperatura entre 20 y 37 °C, preferiblemente a 30 °C. 18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 donde la cepa es la cepa de Weissella cibaria parental con número de depósito CECT 30583 caracterizada porque comprende la mutación T en lugar de G en la posición 35 de la SEQ ID NO: 6. 19. Método para producir alimentos fermentados enriquecidos en dextrano y riboflavina que comprende: (i) inocular la cepa según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, la población bacteriana según la reivindicación 7 o la composición según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 en una masa o mezcla alimentaria, y (ii) fermentar, en presencia de sacarosa, la masa o mezcla alimentaria obtenida en (i) . 20. El método según la reivindicación 19 donde la etapa (ii) se lleva a cabo durante 6 a 24 horas y a una temperatura entre 20 y 35 °C. 21. El método según la reivindicación 19 o 20 donde la masa alimentaria es una masa harinera fermentada. 22. El método según la reivindicación 21 donde la masa harinera comprende harina procedente de granos de cereales o granos de hierbas que se seleccionan de entre: trigo, arroz, maíz, cebada, avena, centeno, alforfón (trigo sarraceno) , quinoa y combinaciones de las mismas. 23. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22 donde la masa alimentaria además comprende al menos una levadura. 24. El método según la reivindicación 23 donde la concentración de la levadura es de entre 107 y 108 unidades formadoras de colonia (UFC) por gramos o mililitros de masa alimentaria. 25. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 24 donde la concentración de la cepa de Weissella cibaria es de entre 107 y 109. 26. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 25 donde la cepa es la cepa de Weissella cibaria parental con número de depósito CECT 30583 caracterizada por que comprende la mutación T en lugar de G en la posición 35 de la SEQ ID NO: 6.

Los productos y servicios protegidos por este registro son:
C12N 1/20

Descripciones:
+ ES-2955258_A1 Cepas mutantes de Weissella cibaria para la sobreproducción de riboflav ina y dextrano La presente invención pertenece al campo técnico de la biotecnología alimentaria, particularmente al desarrollo de bacterias lácticas para la elaboración de productos alimentarios fermentados. En particular, la presente invención se refiere a cepas bacterianas mutantes pertenecientes a la especie Weissella cibaria capaces de sobreproducir dextrano y riboflavina, así como su uso en la elaboración de alimentos fermentados. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las vitaminas pertenecientes al grupo B son esenciales para los seres humanos, ya que no pueden sintetizarlas, al menos en las cantidades requeridas, y las obtienen mayoritariamente, de fuentes exógenas. Entre ellas, se encuentra la vitamina B2 o riboflavina, que es un precursor del flavín mononucleótido (FMN) y del flavín adenín dinucleótido (FAD) , cofactores de las enzimas oxido-reductasas. En el hombre no existen depósitos de riboflavina, por lo que esta vitamina tiene que ser sintetizada por su microbiota o consumida diariamente, eliminándose en la orina el excedente de la ingestión. La deficiencia de esta vitamina, denominada arriboflavinosis, puede provocar problemas de salud, como daños en el hígado y en la piel, cambios cerebrales y del metabolismo de la glucosa. Además, la riboflavina parece estar implicada en la prevención de migraña, anemia, cáncer, hiperglicemia, hipertensión, diabetes mellitus y, directa o indirectamente, en la reducción del estrés oxidativo (Thakur et al, 2017. Crit Rev Food Sci Nutr 57:3650-3660) . La cantidad de riboflavina que se requiere ingerir a diario depende de diversos factores, como la edad, el sexo y el estado fisiológico, siendo la dosis recomendada para un adulto sano entre 0, 9 y 1, 6 mg por día. Concretamente, de acuerdo con el "European Food Information Council", la cantidad de riboflavina diaria recomendada es de 1, 6 mg (Turck et al, 2017. EFSA Journal 15: e04919) . Dichas dosis pueden alcanzarse en los países desarrollados en individuos con dieta equilibrada, al estar presente la vitamina B2 en las hojas verdes de los cereales, semillas (de cereales y frutos secos) y en alimentos de origen nimal como huevos, carne, leche y productos lácteos. Sin embargo, la arriboflavinosis es un problema en países subdesarrollados y puede presentarse en ciertos grupos poblacionales de los países desarrollados, incluyendo adolescentes, mujeres embarazadas, personas de edad avanzada, alcohólicas, con problemas de hígado, vegetarianas y veganas (Mazur-Bialy et al, 2015. J Physiol Pharmacol 66:793-802) . Además de las deficiencias de vitaminas del grupo B por dietas no equilibradas, el procesamiento y la cocción de los vegetales incrementa la pérdida de estas vitaminas, incluyendo la riboflavina (Titcomb et al, 2019. Compr. Rev Food Sci Food Saf 18:1968-1984) . Por ello, se requiere que la industria alimentaria desarrolle alimentos fortificados en vitaminas del grupo B utilizando bacterias sobreproductoras aisladas de distintos nichos ecológicos. Las bacterias del ácido láctico (BAL) pueden sintetizar o utilizar riboflavina durante la fermentación de alimentos, y la utilización de bacterias sobreproductoras de esta vitamina tiene interés industrial. Así, cepas de BAL sobreproductoras pertenecientes a las especies Lactococcus lactis, Lactiplantibacillus plantarum (previamente Lactobacillus plantarum) , Limosilactobacillus fermentum (previamente Lactobacillus fermentum) y Leuconostoc mesenteroides se han propuesto para fortificar alimentos fermentados mediante producción in situ utilizando, entre otras, matrices lácteas o basadas en cereales (Thakur et al., 2016. Microb Biotechnol, 2016, 9:441-451) . Por otra parte, las BAL son capaces de producir exopolisacáridos (EPS) , entre los que destacan los dextranos debido a que actualmente tienen un amplio rango de utilización industrial que incluye su uso como: crioprotectores, humectantes, expansores de plasma sanguíneo o matrices de columnas cromatográficas. Muchas BAL pertenecientes a distintos géneros producen dextrano: Leuconostoc (Zarouret al., 2017. In Microbial Production of Food Ingredients and Additives, eds A. M. Holban, and A. M. Grumezescu, 89-124. Cambridge: Academic press) , Weissella (Besrour-Aouam et al., 2021, Carbohy Polym 253:117254) , Lactobacillus (Nácher-Vázquez et al., 2017. Front Microbiol 8:2281) y Oenococcus (Dimopoulou et al., 2018. Front Microbiol 9:1276) . El dextrano de alto peso molecular producido por BAL (Leuconostoc mesenteroides y lactobacilos) , así como por Saccharomyces cerevisiae, obtuvo el etiquetado de "food grade" emitido por la EFSA en el año 2000. Por este motivo, se utilizan como aditivos para umentar la palatabilidad por la industria de panadería, bollería y pastelería, y en la elaboración de helados, batidos y otras bebidas. Estudios realizados por distintos autores han puesto de manifiesto la mejora de las cualidades del pan, al ser enriquecida la masa fermentada con dextranos (Wang et al., 2018. Food Hydrocholl 84:396-405) . Estos biopolímeros poseen una estructura prácticamente lineal constituida por glucopiranósidos unidos en su cadena principal por enlaces a - (1^6 ) , y un peso molecular elevado. También, la adición de dextrano producido enzimáticamente mejoró el volumen y la textura de pan blanco y de pan conteniendo 20% de harina de centeno (Chen et al., 2016. Int J Food Microbiol 239:95-102) . Así, los dextranos son considerados como uno de los nuevos hidrocoloides que pueden ser usados como ingredientes de los alimentos. Se ha demostrado también que los dextranos de alto peso molecular producidos por las BAL actúan como inmunoestimulantes in vitro y parecen tener propiedades antiinflamatorias (Zarour et al., 2017. Carbohy Polym 174:646-657) , apoyando su utilidad para mejorar la calidad y la funcionalidad de distintos productos, incluyendo la elaboración de alimentos fermentados funcionales. Se han descrito previamente cepas pertenecientes a la especie Weissella cibaria capaces de producir dextrano (Besrour-Aouam et al., 2021. Carbohy Polym 253:117254) , y en EP3105339 A1 se describe el método para producir dextrano a partir de una cepa de W. cibaria. De acuerdo con lo anteriormente descrito, sería de utilidad para la industria alimentaria la obtención de nuevas cepas BAL capaces de sobreproducir tanto dextrano como vitaminas tales como la riboflavina, particularmente durante la elaboración de productos fermentados con capacidades funcionales. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a cepas mutantes pertenecientes a la especie Weissella cibaria capaces de sobreproducir dextrano y riboflavina, las cuales comprenden al menos una mutación en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina (también denominada a lo largo de la invención como "riboswitch FMN") , donde dicha región reguladora comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 6. A partir de cepas parentales de Weissella cibaria capaces de producir concentraciones levadas de dextrano, aisladas de masas madre de panificación Tipo 1 (generadas a partir de fermentación espontánea) de una harina de centeno, preferiblemente de las cepas parentales con número de depósito CECT 30583 (BAL3C-5) , CECT 30585 (BAL3C-7) y CECT 30584 (BAL3C-22) los inventores han obtenido cepas mutantes (BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2, respectivamente) que mantienen la capacidad de producción de dextrano de las cepas parentales (preferiblemente > 2 mg/mL) y que, además, son sobreproductoras de riboflavina (preferiblemente > 0, 8 g/mL) (Tabla 1 y Figura 1) . Además, los inventores han caracterizado las mutaciones responsables de la sobreproducción de riboflavina. Los resultados obtenidos mostraron que las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 presentaban mutaciones en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina (denominada "ríboswitch FMN") (SEQ ID NO: 6) , particularmente en el dominio sensor conservado (aptámero) , modificando su conformación (Figura 2) . En este contexto, la cepa BAL3C-5 B2, que exhibe el fenotipo de mayor sobreproducción de riboflavina, presenta un cambio de T en lugar de G en el nucleótido en posición 35 del "ríboswitch FMN" (G35T en la SEQ ID NO: 6, dando lugar a la secuencia SEQ ID NO: 7) , que desestabilizaría la formación de la hélice P2 del aptámero. La cepa BAL3C-22 B2, con el fenotipo de menor sobreproducción de riboflavina, tiene la citosina C en la posición 43 sustituida por T (C43T en la SEQ ID NO: 6, dando lugar a la secuencia SEQ ID NO: 8) . Esta mutación también afectaría a la estabilidad de la hélice P2. Por su parte, la cepa BAL3C-7 B2 posee una A en la posición 129, en lugar de una G (G129A en la SEQ ID NO: 6, dando lugar a la secuencia SEQ ID NO: 9) , mutación localizada en una posición adyacente a la hélice P6. En consecuencia, la localización de mutaciones en el aptámero del "ríboswitch FMN" (SEQ ID NO: 6) , del operón rib (SEQ ID NO: 1) de las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2, junto con la ausencia de mutaciones en los genes que codifican las enzimas implicadas en la biosíntesis de la riboflavina, indica que dichos cambios son los responsables directos del fenotipo de sobreproducción de riboflavina de estas cepas, manteniéndose la capacidad de sobreproducir dextrano. Por otro lado, los inventores generaron masas harineras fermentadas enriquecidas en riboflavina y dextrano mediante la producción in situ con la cepa Weissella cibaría BAL3C-5 B2 en co-cultivo con una cepa de levadura (Q1 de la especie Saccharomyces cerevisiae aislada de una masa madre de quinoa, colección IBFG) . Los resultados obtenidos indicaron ue las masas harineras fermentadas con BAL3C-5 B2 presentaban un incremento de los niveles tanto de dextrano como de riboflavina (Tabla 2 y 3) . Por último, los inventores han evaluado el contenido de riboflavina y de dextrano durante la elaboración de pan con las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2, BAL3C-22 B2 de W. cibaria, sin adición de levadura, en comparación con sus cepas parentales. Los resultados obtenidos, recogidos en la Tabla 4, mostraron que tanto en las masas harineras fermentadas como en panes piloto (la fermentación se realizó a 30 °C durante 16 h; el pan se obtuvo después de cocinarlo en un horno eléctrico a 210 °C durante 15 min) se mantenían altos niveles de dextrano (>2, 5 mg/g) y se observaba el efecto de las cepas sobreproductoras de riboflavina BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2, provocando un incremento de 1, 7-2, 4 veces sobre los niveles de vitamina detectados en la muestra control (fermentada sin adición de levaduras ni de BAL y horneada) , siendo similares los valor de riboflavina detectados en los panes elaborados con cada una de las cepas mutantes (4, 3­ 4, 8 g/g pan) . Dichas bacterias serán pues de utilidad para la elaboración, por fermentación, de alimentos funcionales enriquecidos in situ en vitamina B2 (riboflavina) y en dextranos, que pueden mejorar las condiciones de textura y organolépticas de los productos y pueden, además, tener potencial como agentes inmunoestimulantes y antiinflamatorios. Entre las posibles aplicaciones de estas cepas mutantes se encuentra su utilización para la fortificación en vitamina B2 de masas fermentadas elaboradas con harinas blancas de trigo y la elaboración de productos de panificación funcionales (tales como, pero sin limitación, panes, galletas, pasta) enriquecidos con vitamina B2, así como de productos con mejores texturas gracias al dextrano, favoreciendo una menor presencia de aditivos añadidos para determinados sectores de la población (por ejemplo, personas con enfermedad celiaca, intolerancias al gluten no celiacas, ancianos, dietas pobres en vitaminas, etc.) . Así, en un primer aspecto la presente invención se refiere a una cepa de Weissella cibaria parental que comprende al menos una mutación en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina ("riboswitch FMN") , donde dicha región reguladora comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6, y donde dicha cepa mutada es sobreproductora de riboflavina y productora de dextrano, de aquí en adelante "la cepa de la invención" . Se entiende por "cepa de Weissella cibaria" cualquier cepa bacteriana que pertenece a la especie de Weissella cibaria, especie de bacteria láctica (BAL) Gram-positiva, ubicada dentro de la familia de las Leuconostocaceae. Preferiblemente, la presente invención se refiere a cepas de Weissella cibaria con calidad alimentaria que son capaces de producir dextrano y riboflavina (cepas parentales) , concretamente de producir concentraciones elevadas de dextrano, pero en ausencia de sobreproducción de riboflavina. Ejemplos de cepas de Weissella cibaria parentales incluyen las cepas con numero de depósito, sin limitar a: CECT 30583 (BAL3C-5) , CECT 30585 (BAL3C-7) y CECT 30584 (BAL3C-22) . En una realización particular de la presente invención, la cepa de Weissella cibaria parental se selecciona de entre las cepas con número de depósito: CECT 30583, CECT 30585 y CECT 30584. La cepa Weissella cibaria BAL3C-5 fue depositada el 22 de Marzo de 2022 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA) . El número de depósito asignado fue el CECT 30583. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) . La cepa Weissella cibaria BAL3C-7 fue depositada el 22 de Marzo de 2022 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA) . El número de depósito asignado fue el CECT 30585. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) . La cepa Weissella cibaria BAL3C-22 fue depositada el 22 de Marzo de 2022 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA) . El número de depósito asignado fue el CECT 30584. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) . La presente invención se refiere a cepas de Weissella cibaria sobreproductoras de extrano, es decir, son cepas que presentan una dextrano sacarasa activa que sintetiza dextrano, y que además comprenden al menos una mutación (en al menos un único nucleótido) en el operón de la síntesis de riboflavina (operón rib) , particularmente en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina, también denominada "riboswitch FMN". Dichas cepas mutantes presentan una capacidad mejorada de producción de riboflavina y, por tanto, son capaces de sobreproducir tanto dextrano como riboflavina. Tal como se usa en el presente documento, los términos "mutante", "cepa mutante", "derivada" o "cepa derivada" son equivalentes y se refieren a cualquier microorganismo, particularmente una bacteria de la especie de Weissella cibaria, que resulta de la mutación o cambio en el ADN de uno (o varios) genes de una cepa de Weissella cibaria sobreproductora de dextrano y que presenta una capacidad mejorada de producción de riboflavina, tal y como se describe en la presente invención. La cepa derivada o mutante puede producirse de forma natural o bien de forma intencionada, por métodos de mutagénesis conocidos en el estado de la técnica como, a modo de ejemplo, el crecimiento del microorganismo original en presencia de agentes mutagénicos o causantes de estrés, o mediante ingeniería genética dirigida a la modificación de genes específicos. Se entiende por cepas con "sobreproducción de riboflavina y dextrano" a aquellas cepas mutantes que producen más cantidad de riboflavina y cantidad similar de dextrano que la cepa parental de Weissella cibaria de la que proceden, transcurrido el mismo o similar periodo de tiempo de fermentación, bajo las mismas o similares condiciones de fermentación (temperatura, pH, anaerobiosis, sin o con aireación, volumen del medio, saturación, densidad óptica, etc.) y en presencia de un medio de cultivo comprendiendo una fuente de carbono o carbohidratos de la misma o similar composición. Así, los mutantes dan lugar a una sobreproducción de riboflavina, en comparación con el rendimiento obtenido cuando se emplea la cepa parental de Weissella cibaria, debido a una expresión desregulada del operón rib. Particularmente, en la presente invención se entiende por sobreproducción de dextrano a una concentración o producción igual o mayor de 2 mg/mL o 2, 8 mg/g, y por sobreproducción de riboflavina a una producción igual o mayor de 0, 8 g/mL ó 4 g/g. En una realización particular de la presente invención, la sobreproducción de dextrano equivale a una concentración igual o mayor de 2 mg/mL, preferiblemente igual o mayor de 2.5 mg/mL, más preferiblemente igual o mayor de 3 mg/mL, más preferiblemente igual o mayor de 4 mg/mL. En otra realización más particular de la presente invención, la sobreproducción de dextrano equivale a una concentración igual o mayor de 5 mg/mL, preferiblemente igual o mayor de 5.5 mg/mL. En otra realización más particular de la presente invención, la sobreproducción de dextrano equivale a una concentración igual o mayor de 2, 8 mg/g, preferiblemente igual o mayor de 3 mg/g. En una realización particular de la presente invención, la sobreproducción de riboflavina equivale a una concentración igual o mayor de 0, 8 g/mL ó 0, 8 g/g, preferiblemente igual o mayor de 1 g/mL ó 1 g/g, más preferiblemente igual o mayor a 2 g/mL ó 1, 25 g/g. En otra realización más particular de la presente invención, la sobreproducción de riboflavina equivale a una concentración igual o mayor de 2, 5 g/mL ó 4, 0 g/g, preferiblemente igual o mayor de 3 g/mL ó 4, 3 g/g, más preferiblemente igual o mayor de 3, 4 g/mL ó 4, 8 g/g. La sobreproducción de dextrano y riboflavina se puede determinar mediante una variedad de métodos conocidos en el estado de la técnica. Ejemplo de métodos para determinar la sobreproducción de dextrano y riboflavina incluyen, sin limitar a: medición de la concentración (peso/volumen) de dextrano y riboflavina en el medio de fermentación, del rendimiento (peso/peso) de dextrano y riboflavina por cantidad de sustrato o el ratio de formación de dextrano y riboflavina (peso/volumen/tiempo) . Es práctica de rutina para un experto en la materia los métodos y técnicas para determinar los niveles de riboflavina y de dextrano. Ejemplos de dichos métodos incluyen, sin limitar a, HPLC, espectrometría de masas, inmunoensayo o ensayos de actividad, particularmente espectrometría de fluorescencia, método del fenol sulfúrico, hidrólisis con dextranasa y cuantificación del producto por cromatografía de gases y espectrometría de masas, medida del índice de refracción. En las bacterias lácticas (BAL) , como en el resto de las bacterias Gram-positivas, las nzimas implicadas en la biosíntesis de riboflavina están codificadas por genes que se agrupan en el operón rib (ribG, ribB, ribA y ribH) , cuya expresión está regulada por el elemento denominado "riboswitch FMN" localizado en la región 5 no traducida de su ARNm, y que codifican, respectivamente las proteínas: RibG: diaminohidroxifosforribosilaminopirimidina desaminasa/5-amino-6- (5-fosforribosilamino) uracil reductasa, con 341 aminoácidos (aa) y 36, 63 kDa, que presenta la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2; RibB: riboflavina sintasa con 195 aa y 21, 16 kDa, que presenta la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3; RibA: 3, 4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa con 393 aa y 42, 9 kDa, que presenta la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4 y RibH: 6, 7-dimetil-8-ribitillumacine sintasa con 195 aa y 16, 07 kDa, que presenta la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 5. El operón rib comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 1, donde dicho operón rib incluye el "riboswitch FMN" (SEQ ID NO: 6) . Dicho operón incluye los genes codificantes de las proteínas Rib anteriormente descritas (SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5) . El "riboswitch FMN" consta de un dominio sensor conservado (aptámero) , capaz de unir el efector FMN, y de un dominio regulador (plataforma de expresión) , que puede exhibir conformaciones alternativas de terminador transcripcional (estado OFF) o de antiterminador (estado ON) . Dicha región reguladora o "riboswitch FMN" comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 6. SEQ ID NO: 6 Secuencia de nucleótidos del "riboswitch FMN" de las cepas CECT 30583, CECT 30585 y CECT 30584 de W. cibaria: Particularmente, las mutaciones responsables de la sobreproducción de riboflavina se disponen en el aptámero, modificando su conformación. El aptámero consiste en una structura pentafoliada, constituida por 5 horquillas (formadas por los tallos P2 a P6) que interaccionan a distancia para formar el sitio de unión del FMN, cerrada por la hélice reguladora (P1) que transmite la señal de unión del efector a la plataforma de expresión. La unión del FMN al aptámero estabiliza la hélice P1 y conduce a la formación de un terminador transcripcional en el dominio regulador (estado OFF) , lo que impide la expresión del operón rib. En ausencia del efector se forma, por el contrario, una estructura antiterminadora que permite la transcripción del operón (estado ON) . Las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 presentan mutaciones de un solo nucleótido dentro de la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina (denominada "riboswitch FMN") (SEQ ID NO: 6) , concretamente en el dominio sensor conservado (aptámero) , modificando su conformación. Particularmente las mutaciones se encuentran en la posición 35, 43 y/o 129 del "riboswitch FMN" (posiciones subrayadas y marcadas en negrita en la SEQ ID NO: 6 descrita anteriormente) y presentan una timina (T) en lugar de guanina (G) en el nucleótido en posición 35 (G35T) , una timina (T) en lugar de una citosina (C) en la posición 43 (C43T) , o una adenina (A) en la posición 129, en lugar de una guanina (G) (G129A) . Así, en otra realización particular de la cepa de la invención, la mutación en la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina se selecciona de entre: (a) T en lugar de G en la posición 35 de la SEQ ID NO: 6 (dando lugar a la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina con secuencia SEQ ID NO: 7) ; (b) T en lugar de C en la posición 43 de la SEQ ID NO: 6 (dando lugar a la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina con secuencia SEQ ID NO: 8) ; o (c) A en lugar de G en la posición 129 de la SEQ ID NO: 6 (dando lugar a la región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina con secuencia SEQ ID NO: 9) . Así, las cepas mutadas de la invención tienen una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 9, donde la SEQ ID NO: 7 corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 6 que comprende la mutación G35T, la SEQ ID NO: 8 corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 6 que comprende la mutación C43T y la SEQ ID NO: 9 corresponde a la secuencia SEQ ID NO: 6 que comprende la mutación G129A. Particularmente, la cepa BAL3C-5 B2 (cepa mutante obtenida a partir de la cepa parental on número de depósito CECT 30583) , que exhibe el fenotipo de mayor sobreproducción de riboflavina, presenta un cambio de T en lugar de G en el nucleótido en posición 35 del "ríboswitch FMN" (G35T) , que desestabilizaría la formación de la hélice P2 del aptámero. La cepa BAL3C-22 B2 (cepa mutante obtenida a partir de la cepa parental con número de depósito CECT 30584) , con el fenotipo de menor sobreproducción de riboflavina, tiene la citosina C en la posición 43 sustituida por T (C43T) . Esta mutación también afectaría a la estabilidad de la hélice P2. Por su parte, la cepa BAL3C-7 B2 (cepa mutante obtenida a partir de la cepa parental con número de depósito CECT 30585) posee una A en la posición 129, en lugar de una G (G129A) . Esta mutación afectaría a la secuencia del espaciado entre las hélices P5 y P6. Así, en otra realización particular, la cepa de la invención es la cepa parental Weissella cibaria con número de depósito CECT 30583, donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. Así, en otra realización particular la cepa de la invención es la cepa parental de Weissella cibaria con número de depósito CECT 30584, donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. Así, en otra realización particular la cepa de la invención es la cepa parental Weissella cibaria con número de depósito CECT 30585, donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9. Como sabe un experto en la materia, la cepa de la invención o la cepa derivada o mutante puede estar comprendida en una población bacteriana. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una población bacteriana que comprende la cepa de la invención, denominada de aquí en adelante "población bacteriana de la invención". El término "población bacteriana" se refiere a un conjunto de microorganismos donde al menos hay una célula de la cepa de la invención, en cualquier fase del estado de desarrollo en cualquier fase de crecimiento. Como entiende el experto en la materia, la cepa de la invención o la población de la invención, pueden estar contenidos dentro de una composición. Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende la cepa de la invención o la población de la invención, así como cualquier combinación de las mismas, de aquí en adelante la "composición de la invención". El término "composición", definida de forma general, es un conjunto de componentes que está formado al menos por la cepa de la invención en cualquier concentración o la población de la cepa de la invención, o por una combinación de las mismas. Particularmente, la composición de la invención puede ser una composición alimentaria. El término "composición alimentaria" de la presente invención se refiere a un alimento o a una composición necesaria para la elaboración o producción de un alimento que, con independencia de aportar nutrientes al sujeto que lo toma, afecta beneficiosamente a una o varias funciones del organismo, de manera que proporciona un mejor estado de salud y bienestar. Como consecuencia, dicha composición alimentaria puede ser destinada a la prevención y/o tratamiento de una enfermedad o del factor causante de una enfermedad. En otra realización más particular, el alimento se selecciona de la lista que comprende: producto lácteo, producto de panificación, producto vegetal, producto cárnico, aperitivo, chocolate, bebida o alimento infantil. Opcionalmente, la composición según cualquiera de las definidas anteriormente puede comprender además al menos un aditivo. Así, en una realización particular, la composición de la invención comprende, además, al menos un aditivo. El término "aditivo" se refiere a un compuesto, sustancia, solución, producto que puede mejorar, potenciar o complementar la actividad de una cepa de la especie Weissella cibaria, con el fin de mejorar o conservar el sabor, el aspecto, la frescura y la calidad, manteniendo sus propiedades químicas y organolépticas. Los ejemplos de aditivos incluyen, sin limitación, plantas o extractos de plantas o componentes (polifenoles, aceite de argán, proteínas de clarificación) , y productos químicos o enzimas (agentes sulfitantes, lisozima, licosidasas, pectinasas, hemicelulasas) o aditivos alimentarios. En otra realización particular de la composición de la invención, el aditivo es un aditivo alimentario. Ejemplos de aditivos alimentarios incluyen, sin limitar a, sustancias que impiden las alteraciones químicas biológicas (antioxidantes, sinérgicos de antioxidantes y conservantes) , sustancias estabilizadoras de las características físicas (emulgentes, espesantes, gelificantes, antiespumantes, antiapelmazantes, antiaglutinantes, humectantes, reguladores de pH) , sustancias correctoras de las cualidades plásticas (mejoradores de la panificación, correctores de la vinificación, reguladores de la maduración) o sustancias modificadoras de los caracteres organolépticos (colorantes, potenciadores del sabor, edulcorantes artificiales, aromas) y probióticos o prebióticos. Es práctica de rutina para un experto en la materia calcular la cantidad de cepa de la invención, o en la población bacteriana o en la composición de la invención, empleada para la producción de dextrano y riboflavina en la presente invención. En una realización particular de la presente invención, la concentración de la cepa de la invención es entre 107 y 1010 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mililitro de composición final. En otra realización particular, la concentración de la cepa de la invención es entre 108 y 109 UFC/g o mL de la composición final. La cepa, población bacteriana o composición de la invención son capaces de sobreproducir dextrano y riboflavina y, además, serían útiles para la elaboración de alimentos funcionales enriquecidos in situ en vitamina B2 (riboflavina) y en dextranos, que pueden mejorar las condiciones de textura y organolépticas de alimentos. Así, otro aspecto de la presente invención es el uso de la cepa, población bacteriana o composición de la invención para la producción de dextrano y riboflavina. Además, otro aspecto de la presente invención es el uso de la cepa, población bacteriana o composición de la invención para la producción de alimentos fermentados experimentales nriquecidos en dextrano y riboflavina. El término "alimentos fermentados", tal como se usa en la presente invención, se refiere a alimentos o composiciones alimentarias que han sido transformados o fermentados por la acción de bacterias y/o levaduras sobre los glúcidos que contienen, alterando sus características bioquímicas. Durante este proceso, los azúcares se convierten en ácidos, gas o alcohol, que actúan como conservantes naturales. Ejemplos de alimentos fermentados incluyen sin limitar a: masas harineras fermentadas o pan, queso, embutidos, bebidas alcohólicas (cerveza o vino) , yogurt, kéfir, chucrut crudo y kimchi tradicional. Otra realización particular de la presente invención es el uso de la cepa, población bacteriana o composición de la invención para la producción de masas harineras fermentadas. Las cepas bacterianas de la presente invención son de utilidad para la producción de dextrano y riboflavina. Así, otro aspecto de la presente invención es un método para la producción de dextrano y riboflavina, de aquí en adelante el "primer método de la invención", que comprende: (i) cultivar la cepa de Weissella cibaria, la población bacteriana o la composición de la invención en un medio de cultivo que comprende suplementación con sacarosa, y (ii) recuperar del medio de cultivo el dextrano y la riboflavina obtenidos en (i) . Los términos "cepa de Weissella cibaria", "población bacteriana" y "composición" han sido definidos en párrafos anteriores del presente documento, y se aplican de igual forma a este aspecto de la invención, así como a todas sus realizaciones particulares (solas o en combinación) . Como entiende el experto en la materia, el crecimiento o cultivo de un microorganismo se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende los componentes necesarios para que dicho microorganismo prolifere. Así, en el presente documento, el término "medio de cultivo" se refiere a una sustancia, un compuesto, una mezcla, una disolución que comprende la fuente de carbono necesaria para el crecimiento y metabolismo del microorganismo, en donde dicho medio de cultivo puede ser sólido, semisólido, semilíquido o líquido. "Medios de cultivo" adecuados para ser empleados en la presente invención son todos aquellos conocidos en el estado de la técnica como apropiados para el crecimiento, actividad fermentadora y mantenimiento en cultivo de cepas de Weissella cibaria. El medio de cultivo puede comprender, además, sales y/o tampones. Ejemplos de estos medios de cultivo son, sin limitar a, MRS (medio de Man, Rogosa y Sharpe, Condalab) , RAM (Medio de ensayo de riboflavina, Difco) o RAMS (Medio de ensayo de riboflavina con sacarosa) . El medio de cultivo está, además, suplementado con una fuente de carbono, la cual puede comprender, por ejemplo, pero sin limitarnos, glucosa, sacarosa, maltosa, fructosa, xilosa, arabinosa, o una mezcla de ambos tipos de azúcares, preferiblemente con sacarosa. El cultivo de la bacteria Weisella cibaria tiene que llevarse a cabo en las condiciones adecuadas para que las bacterias puedan crecer y sintetizar dextrano y riboflavina a partir de la fuente de carbono. Las condiciones adecuadas de pH, temperatura, humedad, etc., necesarias para cultivar Weissella cibaria son ampliamente conocidas en el estado de la técnica. En general, el crecimiento de dichas bacterias requiere de una temperatura por encima de 15°C y por debajo de 45 °C, y de un tiempo entre 12 a 48 horas. Así, en una realización particular del primer método de la invención, la etapa (i) se lleva a cabo durante 15 a 35 horas y una temperatura entre 20 °C y 37 °C. En otra realización particular del primer método de la invención, la etapa (i) se lleva a cabo a una temperatura de entre 25 °C y 35 °C, preferiblemente de entre 28 °C y 32 °C. En otra realización todavía más particular, la etapa (i) del método de la invención se lleva a cabo a una temperatura de 30 °C. Así, en una realización particular del primer método de la invención, la etapa (i) se lleva a cabo durante un tiempo entre 16 a 25 horas, preferiblemente durante 23 horas. Una vez cultivadas las cepas de Weissella cibaria durante la etapa (i) del primer método de la invención, se recupera del medio de cultivo el dextrano y la riboflavina producidos. El término "recuperación", tal y como se emplea en la etapa (ii) del primer método para la roducción de dextrano y riboflavina de la invención, se refiere a la recogida de dichos compuestos obtenidos después de la etapa (i) . Dicha recuperación se puede llevar a cabo por cualquier procedimiento conocido en la técnica, incluyendo métodos mecánicos y/o manuales, tal como centrifugación del cultivo bacteriano, recogida del sobrenadante y precipitación con etanol o concentración por liofilización. Mediante el uso de las cepas Weissella cibaria BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 se pueden obtener riboflavina y dextrano. Así, en otra realización particular del primer método de la invención, la cepa de Weissella cibaria de la etapa (i) es la cepa parental con número de depósito CECT 30583 (BAL3C-5) , donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. Así, en otra realización particular del primer método de la invención, la cepa de Weissella cibaria de la etapa (i) es la cepa parental con número de depósito CECT 30584 (BAL3C-22) donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. Así, en otra realización particular del primer método de la invención, la cepa de Weissella cibaria de la etapa (i) es la cepa parental con número de depósito CECT 30585 (BAL3C-7) donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9. Particularmente, la cepa BAL3C-5 B2 (cepa mutante obtenida a partir de la cepa parental con número de depósito CECT 30583) , la cual presenta un cambio de T en lugar de G en el nucleótido en posición 35 del "riboswitch FMN" (G35T) , exhibe el fenotipo de mayor sobreproducción de riboflavina. Así, en otra realización más particular del primer método de la invención, la etapa (i) se refiere a cultivar la cepa parental de Weissella cibaria con número de depósito CECT 30583 donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7, es decir, la cepa mutante derivada de BAL3C-5. Las cepas bacterianas de la presente invención son de utilidad para la elaboración, por fermentación, de alimentos funcionales enriquecidos in situ en vitamina B2 (riboflavina) y en dextranos que pueden mejorar las condiciones de textura y organolépticas de los productos. Entre las posibles aplicaciones de estas cepas mutantes se encuentra su utilización para la fortificación en vitamina B2 de harinas blancas de trigo y la elaboración de productos de panificación funcionales (panes, galletas, pasta) enriquecidos con vitamina B2. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para producir alimentos fermentados enriquecidos en dextrano y riboflavina, de aquí en adelante el "segundo método de la invención" que comprende: (i) inocular la cepa, la población bacteriana o la composición de la invención en una masa o mezcla alimentaria, y (ii) fermentar, en presencia de sacarosa, la masa alimentaria obtenida en (i) . Los términos "cepa de Weissella cibaria", "población bacteriana", "composición" y "alimentos fermentados" han sido definidos en párrafos anteriores del presente documento, y se aplican de igual forma a este aspecto de la invención, así como a todas sus realizaciones particulares (solas o en combinación) . En una realización particular del segundo método de la invención, la etapa (ii) se lleva a cabo a una temperatura entre 20 y 35 °C, durante 6 a 24 horas. En una realización particular del segundo método de la invención, la masa alimentaria es una masa harinera fermentada En otra realización particular del segundo método de la invención, la masa panaria comprende harina procedente de granos de cereales o de hierbas que se seleccionan de entre: trigo, arroz, maíz, cebada, avena, centeno, alforfón o trigo sarraceno, quinoa y combinaciones entre las mismas. Como sabe un experto en la materia, las masas de panificación de los alimentos fermentados elaborados con cereales o pseudocereales (por ejemplo, pan o bollería) además pueden comprender levaduras, para llevar a cabo la fermentación del producto alimentario. Así, en otra realización particular, la masa alimentaria, además, comprende al menos una levadura. El término "levadura" tal como se usa en el presente documento se refiere a microorganismos denominados hongos, capaces de llevar a cabo la descomposición mediante fermentación de diversos compuestos orgánicos, principalmente azúcares o hidratos de carbono. Ejemplos de especies de levaduras en la presente invención incluyen, sin limitar a, Saccharomyces cerevisiae. Es práctica de rutina para un experto en la materia calcular la cantidad de cepa de la invención, o en la población bacteriana o en la composición de la invención, o en su caso la cantidad de la levadura, empleada para la producción de dextrano y riboflavina en la presente invención. En una realización particular del segundo método de la presente invención, la concentración de la cepa de Weissella cibaria es entre 108 y 1010 y/o la concentración de la levadura es entre 106 y 109 unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo o mililitro de masa alimentaria. En otra realización particular, la concentración de la cepa de la invención es entre 107 y 109 y de levadura es entre 107 y 108 UFC/g o mL de la composición final. Particularmente, mediante el uso de las cepas Weissella cibaria BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 se pueden obtener masas harineras fermentadas enriquecidas en riboflavina y dextrano, tanto en co-cultivo con levadura como sin levadura. Así, en otra realización particular del segundo método de la invención, la cepa de Weissella cibaria de la etapa (i) es la cepa parental con número de depósito CECT 30583 (BAL3C-5) , donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 7. Así, en otra realización particular del segundo método de la invención, la cepa de Weissella cibaria de la etapa (i) es la cepa parental con número de depósito CECT 30584 (BAL3C-22) donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de iboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 8. Así, en otra realización particular del segundo método de la invención, la cepa de Weissella cibaria de la etapa (i) es la cepa parental con número de depósito CECT 30585 (BAL3C-7) donde dicha cepa comprende una región reguladora del operón de la síntesis de riboflavina que comprende o consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Detección de la producción de riboflavina por las cepas de W. cibaria sobreproductoras de riboflavina (BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2) y sus cepas parentales (BAL3C-5, BAL3C-7 y BAL3C-22) productoras de la vitamina. Las bacterias se cultivaron en medio conteniendo glucosa (RAM) o glucosa más sacarosa (RAMS) y se midió en tiempo real su crecimiento (DO600 nm) y la fluorescencia emitida por la riboflavina producida por ellas. Figura 2. Representación esquemática de las posibles conformaciones "ON" y OFF" del "riboswitch FMN". El mecanismo de actuación del "riboswitch FMN" silvestre se basa en el cambio, promovido por la unión del efector, desde el estado "ON" (estructura antiterminadora) al estado "OFF" (terminador transcripcional) . Sobre la estructura del estado "OFF" se indica el aptámero y la plataforma de expresión. La secuencia del terminador transcripcional aparece resaltada en rojo. Figura 3. Detección in situ de la actividad dextrano sacarasa (Dsr) en sobrenadantes de cultivos de BAL libres de células. Las W. cibaria indicadas (BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2) se cultivaron en los medios RAM o RAMS y los sobrenadantes de los cultivos fueron fraccionados en geles de SDS-poliacrilamida y, después de renaturalizar las proteínas, fueron analizados in situ para detectar la actividad Dsr. S, Estándar de peso molecular "Precision Plus Protein Dual Color Standards" (Bio-Rad) . EJEMPLOS A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad del producto de la invención. Ejemplo 1. Selección de las cepas sobreproductoras de riboflavina Las cepas CECT 30583 (BAL3C-5) , CECT 30585 (BAL3C-7) y CECT 30584 (BAL3C-22) pertenecientes a la especie W. cibaria y aisladas de masas madre de harina de centeno (Llamas-Arriba et al., 2021. Foods 10:2004) se utilizaron para seleccionar cepas mutantes sobreproductoras de vitamina B2 por tratamiento con roseoflavina. Las 3 bacterias parentales fueron crecidas independientemente en medio MRS (medio de Man, Rogosa y Sharpe, Condalab) a 30 °C hasta una densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm (DO600 nm) de 1, 5. Posteriormente, los cultivos fueron diluidos 1:100 en medio RAM (riboflavin assay medium, Difco) carente de riboflavina suplementado con roseoflavina (10 g/mL) e incubados en las mismas condiciones hasta que alcanzaron el inicio de la fase estacionaria. Posteriormente, las bacterias fueron sometidas a concentraciones crecientes de roseoflavina (50 g/mL, 75 g/mL, 100 g/mL, 150 g/mL, 200 g/mL) mediante dilución secuencial y posterior crecimiento en medio suplementado con dicho compuesto. Los cultivos de W. cibaria BAL3C-7 y BAL3C-22 mostraron crecimiento incluso en presencia de una concentración de roseoflavina de 200 g/mL, mientras que W. cibaria BAL3C-5 sólo mostró tolerancia a 150 g/mL del compuesto. Estos cultivos se sembraron en placas Petri conteniendo MRS suplementado con agar al 1, 6%, para aislar colonias de cepas resistentes a roseoflavina, después de su crecimiento a 30 °C durante 48 h. Seguidamente, las bacterias contenidas en 3 de las colonias (una por cada cepa parental) fueron recuperadas por crecimiento en medio MRS líquido. Además, estos 3 aislados, una vez comprobada su resistencia a roseoflavina por crecimiento en MRS en presencia del compuesto, fueron conservados a -80°C en medio MRS sin roseoflavina y suplementado con glicerol al 20%. Ejemplo 2. Evaluación de la capacidad de producción de riboflavina y dextrano de las bacterias lácticas en medio de cultivo Los tres aislados descritos en el ejemplo 1 fueron denominados W. cibaria BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 y fueron analizados junto con sus respectivas cepas arentales W. cibaria CECT 30583 (BAL3C-5) , CECT 30585 (BAL3C-7) y CECT 30584 (BAL3C-22) . El dextrano es producido extracelularmente por las BAL en una reacción catalizada por dextrano sacarasas (Dsr) utilizando sacarosa como sustrato. Además, la riboflavina producida por las bacterias puede ser secretada al medio extracelular. Así, se analizaron los sobrenadantes de cultivos bacterianos de las 6 cepas crecidas en el medio RAM comercial conteniendo 2% de glucosa o en RAMS suplementado con sacarosa al 2% durante 23 h a 30 °C, para determinar los niveles de riboflavina mediante espectrometría de fluorescencia como se ha descrito previamente (Mohedano et al., 2019. Front Microbio! 10:1748) y de dextrano por el método del fenol sulfúrico (Besrour-Aouam et al., 2021. Carbohy Polym 253:117254) . La biomasa celular alcanzada se estimó mediante medición de la DO600 nm. Los resultados obtenidos aparecen recogidos en la Tabla 1. Tabla 1. Análisis comparativo de las cepas de W. cibaria sobreproductoras de riboflavina y de sus correspondientes cepas parentales. (1) Relación de la producción de los compuestos por cada una de las cepas sobreproductoras de riboflavina (B2) con respecto a su correspondiente cepa silvestre (wt) . La suplementación del medio con sacarosa (RAMS versus RAM) conllevó que las 6 cepas analizadas alcanzaran, después de 23 h de crecimiento, una biomasa más elevada, según se estimó por los valores de DO600 nm detectados. Concerniente a la producción de dextrano, las 6 bacterias fueron capaces de producir el biopolímero a unos niveles elevados (> 5 mg/mL) en el medio RAMS. Además, no se observó diferencia significativa entre la producción de EPS de las cepas mutantes sobreproductoras de riboflavina (denominadas B2) y sus respectivas cepas parentales. Respecto a la producción de la riboflavina, las bacterias B2 mostraron unos niveles superiores a los de sus respectivas cepas silvestres en los dos medios de crecimiento RAM (incremento de 28-61 veces) y RAMS (incremento de 9-19 veces) , siendo superior la producción de la vitamina B2 por todas las cepas en el medio suplementado con sacarosa. Además, la cepa BAL3C-5 B2 fue la que mostró los niveles más elevados de producción de riboflavina (3, 45 g/mL en medio RAMS) . Así, los resultados obtenidos mostraron que el análisis de los sobrenadantes de las BAL en el medio RAMS permitía valorar cuantitativamente el dextrano producido y la vitamina B2 secretada por ellas. Además, dichos resultados demostraron que las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 eran sobreproductoras de riboflavina y mantenían la capacidad de sobreproducir dextrano. También se evaluó la capacidad de las 6 bacterias lácticas para producir riboflavina durante su crecimiento en los medio RAMS y RAM en placas de microtítulo (Sterile 96-Well Optical White w/Lid Cell Culture, Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, United States) en un equipo Varioskan Flask System (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States) . Para ello, se realizaron medidas simultáneas, en tiempo real, de la DO600 nm de los cultivos y de la fluorescencia de la vitamina B2 producida por ellos (excitación a una longitud de onda de 440 nm y detección de emisión a 520 nm) . Los resultados obtenidos (Figura 1) confirmaron los descritos en la Tabla 1 y revelaron la sobreproducción de riboflavina por las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 durante las fases de crecimiento exponencial y estacionaria, aunque no se observaron diferencias entre el crecimiento de las cepas sobreproductoras y sus respectivas cepas parentales durante el crecimiento exponencial. Ejemplo 3. Caracterización de las mutaciones de las cepas sobreproductoras de riboflavina Se determinó la secuencia completa de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) del operón rib (incluyendo el regulador "riboswitch FMN) de las cepas silvestres CECT 30583 (BAL3C-5) , CECT 30585 (BAL3C-7) y CECT 30584 (BAL3C-22) de W. cibaria y de las correspondientes cepas isogénicas sobreproductoras de riboflavina (BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2) . La determinación se realizó por secuenciación automática basada en el método de Sanger, con una estrategia de "primer walking" y utilizando fragmentos de PCR que contenían la secuencia completa del operón rib como ADN molde. A partir de la ecuencia de los genes rib se infirió la secuencia de aminoácidos de las proteínas RibG (SEQ ID NO: 2) , RibB (SEQ ID NO: 3) , RibA (SEQ ID NO: 4) , y RibH (SEQ ID NO: 5) con la ayuda de los programas bioinformáticos contenidos en el paquete DNASTAR Lasergene 15. Los resultados obtenidos mostraron que la secuencia era idéntica en las tres cepas silvestres, mientras que cada una de las cepas con fenotipo sobreproductor de riboflavina presentaba un cambio en un solo nucleótido dentro del aptámero del "riboswitch FMN". En este contexto, la cepa BAL3C-5 B2, que exhibe el fenotipo de mayor sobreproducción de riboflavina de las 3 cepas mutantes estudiadas, presenta un cambio G ^ U en el nucleótido en posición 35 del "riboswitch FMN" (numerado a partir del sitio predicho de iniciación de la transcripción) , que desestabilizaría la formación de la hélice P2 del aptámero. La cepa BAL3C-22 B2, con el fenotipo de menor sobreproducción de riboflavina, tiene la C43 (que aparearía con la G35 en el aptámero silvestre) sustituida por U. Esta mutación también afectaría a la estabilidad de la hélice P2, aunque en menor grado que la mutación encontrada en la cepa BAL3C-5 B2, puesto que aún podría formarse un par GU. Por su parte, la cepa BAL3C-7 B2 posee una A en la posición 129, en lugar de una G. Estudios cristalográficos previos han demostrado que la G conservada en la misma posición relativa del aptámero está implicada en la interacción con el efector FMN. En consecuencia, la localización de mutaciones en el aptámero del riboswitch FMN del operón rib de las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2 indica que dichos cambios son los responsables directos del fenotipo de sobreproducción de riboflavina de estas cepas. Ejemplo 4. Identificación de los determinantes de la producción de dextrano Se determinó la secuencia de nucleótidos de los genes dsr de las cepas sobreproductoras de riboflavina (SEQ ID NO: 10) como se ha indicado en el ejemplo 3. Los genes de las 3 cepas mostraron una longitud de 4.342 nt, fueron idénticos entre sí y sólo mostraron una identidad de nucleótidos del 100% con el gen dsr de W. cibaria CH2, cepa aislada de queso de los Himalayas occidentales. La secuencia de aminoácidos de las Dsr se infirió a partir de la secuencia de nucleótidos de los genes gtf con el programa EditSeq 15 software (DNASTAR R Lasergene 15) y mostró que codifican una proteína de 159.099 Da (SEQ ID NO: 11, que posee en su extremo amino-terminal un péptido señal implicado en el procesamiento y secreción en bacterias Gram-positivas. El análisis de la secuencia de minoácidos de la proteína con el programa SignalP-5.0 permitió predecir que la Dsr extracelular procesada posee una masa molecular de 156.411 Da. Con el objetivo de detectar in situ y en gel la forma activa de las Dsr, se analizaron los sobrenadantes de cultivos de las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2 y BAL3C-22 B2, crecidas en medio RAMS y RAM durante 24 h como se ha descrito en el ejemplo 2, mediante electroforesis en un gel de SDS poliacrilamida al 8% a un voltaje constante de 100 V. Después, para detectar la actividad de las Dsr se utilizó el procedimiento descrito previamente (Besrour-Aouam et al., 2021. Carbohy Polym 253:117254) . Este método conlleva: (i) la eliminación del SDS mediante lavados, (ii) la síntesis de dextrano por las Dsr durante 17 h en presencia de tampón acetato sódico suplementado con 10% sacarosa y (iii) el revelado de la actividad por tinción con ácido per y ódico de Schiff. Posteriormente, las proteínas se tiñeron con azul de Coomassie al 25% y su peso molecular se estimó por referencia al marcador Precision Plus Protein Dual Color Standards (Bio-Rad) , que incluye polipéptidos en el rango de 10-250 kDa. El revelado del gel (Figura 3) mostró una banda intensa de actividad aproximadamente a la posición esperada (156 kDa) en los sobrenadantes de las 3 cepas de W. cibaria crecidas en medio RAMS y una banda muy tenue en los cultivos crecidos en medio RAM. En consecuencia, los resultados obtenidos revelaron que la producción de las Dsr es inducida cuando la sacarosa está presente en el medio de cultivo. E jemplo 5. Evaluación de las cepas W. cibaria BAL3C-5 B2 y W. cibaria BAL3C-5 durante la e laboración de masas harineras ferm entadas Durante el crecimiento en medio de cultivo, la cepa BAL3C-5 B2 fue, entre las 6 bacterias estudiadas, la que mostró la mayor capacidad para sobreproducir riboflavina (Tabla 1 y Figura 1) . Por ello, se procedió a evaluar la capacidad de dicha cepa y la de su cepa parental para producir vitamina B2 y dextrano durante la fermentación de harinas, tanto individualmente como co-inoculadas con la levadura Saccharomyces cerevisiae Q1. Las harinas utilizadas fueron ecológicas y de alta extracción (integrales o semi-integrales) : de trigo panificable de fuerza W200 ("Molinos del Duero y Compañía General de Harinas, S.L." Carr. de Villalpando, 13, 49029 Zamora) y las del pseudocereal trigo sarraceno (buckwheat) y quinoa suministradas por Molendum Ingredients (Calle de la Milana S/N, 49530 Coreses, Zamora) . Para generar las masas harineras fermentadas, se cultivó por una parte la levadura Q1, a partir de un cultivo saturado de 12-24 h en medio rico YEPD (extracto de levadura, peptona, dextrosa al 2%) , inoculándose células de las levaduras en 50 mL de medio fresco YEPD, a una DO600 nm inicial de « 0, 1 (1 unidad de DO600 nm equivale a « 107 células/mL) . Los cultivos se incubaron en matraces de 250 mL con aireación constante, a 28 °C y agitación orbital a 230 rpm. Las células se recogieron por centrifugación a una DO600nm <1 en fase exponencial temprana-media, cuando las levaduras están dividiéndose (gemando) activamente (5-6 h) , y se lavaron dos veces con agua destilada estéril para preparar el inóculo correspondiente (diluciones) para fermentar harinas. Por otra parte, las BAL se cultivaron en medio MRSS (sacarosa al 5%) con un pH inicial ajustado a 7, 0 a 30 °C y bajo aireación constante. Las células bacterianas se recogieron por centrifugación a las 2-3 h, se lavaron 2 veces con solución salina al 0, 9% y se efectuaron las diluciones apropiadas para inocular masas harineras. Los microorganismos contenidos en 13 mL de agua con sacarosa al 5% [3x108 UFC/g de masa de las BAL (BAL3C-5 o BAL3C-5 B2) y/o 3x107 UFC/g de masa de levadura Q1] y se mezclaron con 40 g de cada harina (quinoa + trigo al 50% o solamente trigo sarraceno) y 80 mL de sacarosa al 5% (hidratación 70%) , para inducir in situ la síntesis de dextrano por las BAL. Se mezclaron los ingredientes con espátulas alargadas hasta formar una masa homogénea y los tubos conteniendo las masas se incubaron en una estufa a 28 °C durante 24 h. Posteriormente, se analizaron las masas fermentadas evaluando el dextrano extracelular producido por las cepas BAL3C-5 B2 y BAL3C-5, así como la riboflavina secretada por dichas BAL y/o por la levadura Q1. Para ello, las masas generadas fueron diluidas 1:2 con agua (volumen final 3) y centrifugadas a 8000 x g durante 20 min. El sobrenadante obtenido fue utilizado para determinar fluorimétricamente los niveles de riboflavina como se ha indicado previamente y para determinar los niveles de exopolisacáridos (EPS) después de 3 precipitaciones con 3 volúmenes de etanol absoluto y valoración de azúcares neutros por el método del fenol sulfúrico. Para calcular la concentración de la vitamina o del EPS se utilizaron, respectivamente, curvas de calibrado de la riboflavina o de glucosa disueltas en agua. En la Tabla 2, se presentan los valores obtenidos para cada una de las muestras analizadas, así como las contribuciones iniciales de riboflavina de las masas no fermentadas y elaboradas con harinas de trigo y quinoa (TQ) o de trigo sarraceno (TS) . Los resultados obtenidos indicaron que las harinas españolas empleadas para elaborar las asas poseen un alto contenido de riboflavina soluble (0, 28-0, 34 jg /g masa) . En todas las masas fermentadas se observó un incremento de los niveles de riboflavina, incluso cuando estas contenían sólo la levadura Q1 (0, 64-0, 7 jg /g) . Además, se observó que, con los dos tipos de harina utilizados, la fermentación realizada con Q1 y BAL3C-5 (0, 69 jg /g, TQ2 y 0, 83 jg /g, TS2) y, en mayor proporción, con BAL3C-5 B2 (0, 78 |jg/g TQ3 y 1, 25 jg /g TS3) generaba niveles superiores de la vitamina B2 soluble. Tabla 2. Determinación de la concentración de vitamina B2 soluble presente en las masas harineras fermentadas. En la Tabla 3 aparecen recogidos los resultados obtenidos al cuantificar el dextrano presente en las masas. Todas las masas fermentadas con microorganismos mostraron unos niveles de EPS solubles (1-1, 9 mg/g; TQ1-TQ3 y TS1-TS3) muy superiores a los detectados en las masas sin fermentar (0, 22-0, 26 mg/g; TQ y TS) . Además, la cofermentación con las BAL resultó en un incremento superior del contenido de EPS (hasta 8, 6 veces) , más acusado en el caso de las masas elaboradas con trigo y quinoa y, como se esperaba, no se observaron grandes diferencias entre las masas harineras fermentadas co-inoculadas con BAL3C-5 B2 (TQ3 y TS3) y con CECT 30583 (BAL3C-5) (TQ2 y TS2) . Tabla 3. Determinación de la concentración de EPS soluble presente en las masas harineras fermentadas. Ejemplo 6. Evaluación de las cepas BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2, BAL3C-22 B2 de W. cibaria y sus cepas parentales durante la elaboración de pan sin adición de levadura Las BAL se evaluaron independientemente realizando una fermentación control sin adición de BAL, tan sólo con la microbiota autóctona, presente en las masas harineras sin inocular (control) . Los microorganismos se cultivaron como se ha descrito en el ejemplo 5. La harina utilizada en este caso fue la harina de trigo ecológica refinada con fuerza W200, de Molinos del Duero (Cerecinos de Campos, Zamora) . Se elaboró una masa con 400 g de harina, 300 mL de agua con 5% de sacarosa y 0, 64 % de sal, se mezcló bien con una amasadora y se dividieron porciones de 50 g de masa, que fueron inoculadas con 1x109 UFC de BAL/g. Estas piezas se amasaron y dividieron en 3 micro-panes de 15 g cada uno. La fermentación se realizó a 30 °C durante 16 h. Tras la fermentación, y antes de hornear a 210 °C durante 15 min, se realizó un recuento de UFC/g en medio MRS-agar para detectar BAL y en medio YEPD para detectar levaduras (Tabla 4) . Los datos obtenidos se detallan en la Tabla 4. En la masa no inoculada con bacterias, como se esperaba, sólo se detectaron bajas concentraciones de las BAL (4, 37x106 UFC/g) presentes en la microbiota de las masas. Además, en todas las masas fermentadas con las BAL se detectaron valores >1x109 UFC/g. También, en todas las masas analizadas se observó un nivel prácticamente despreciable de levaduras endógenas de las harinas (1, 8-6, 0x101 UFC/g) . Posteriormente se analizaron muestras de las masas sin hornear y de los panes obtenidos tras el horneado. Para determinar, a partir de las mismas muestras, la concentración total de riboflavina y de dextrano presentes en los panes, se diseñó y utilizó la siguiente metodología. Se analizaron 5 g de las masas fermentadas sin hornear y 5 g de los panes horneados. Las muestras se introdujeron en frascos de 100 mL, se adicionaron 25 mL de HCl 0, 1M y se calentaron a 121 °C durante 60 min. Posteriormente, se neutralizó la suspensión por adición de acetato sódico 4 M hasta alcanzar un pH de 6, 5. Seguidamente, se adicionaron 0, 5 mL de una solución de la dextranasa de Chaetomium erraticum (Sigma-Aldrich-D0443, 0, 6 g del enzima por muestra) y las muestras se incubaron a 30 °C durante 18 h. Tras la incubación, las muestras se llevaron a un volumen de 50 mL por adición de HCl 0, 01 M y, para eliminar los residuos sólidos, se centrifugaron a 8, 000 x g durante 10 min. Los sobrenadantes se filtraron a través de una gasa y posteriormente a través de un filtro de 0, 22 m. Finalmente, el filtrado se alicuotó y se mantuvo congelado a -20 °C hasta su posterior análisis. Tabla 4. Análisis del contenido total de riboflavina y dextrano en masas fermentadas 16 h y en los panes generados por horneado, así como del contenido de dextrano en los panes. 1El contenido de la riboflavina y de dextrano en la harina procesada como los panes fue de 1, 54±0, 03 yg/g y de 0, 24±0, 05 mg/g, respectivamente. El procedimiento antedicho conlleva la conversión de las flavinas presentes en la muestra en riboflavina, que fue cuantificada mediante espectrometría de fluorescencia como se ha descrito en el ejemplo 2. Los resultados obtenidos, recogidos en la Tabla 4, mostraron que tanto en las masas fermentadas como en los panes se observaba el efecto de las 3 BAL sobreproductoras de riboflavina BAL3C-5 B2, BAL3C-7 B2, BAL3C-22 B2 provocando un incremento de 1, 7-2, 4 veces sobre los niveles de vitamina detectados en la muestra control, siendo el valor más elevado el detectado con la cepa BAL3C-5 B2 (4, 25 jg /g pan) . Por otra parte, las muestras obtenidas a partir de los panes fueron utilizadas para determinar la concentración de dextrano presentes en ellas. El tratamiento con la dextranasa de C. erraticum, descrito con anterioridad en este ejemplo 6, hidroliza específicamente el dextrano a isomaltosa, cuya concentración fue determinada por análisis e 50 L de las muestras mediante cromatografía de gases y espectrometría de masas. Los resultados obtenidos (Tabla 4) revelaron que los panes obtenidos mediante fermentaciones con las 6 BAL analizadas mostraban altos niveles de dextrano (2, 8-3, 2 mg/g) muy superiores a los detectados en el pan control (0, 79 mg/g) . También, mostraron que la cepa BAL3C-5 B2 era la mejor productora de dextrano durante las fermentaciones, como ya se había observado con los resultados del ejemplo 5. Además, la metodología utilizada mostró ser adecuada para generar muestras idóneas para valorar flavinas totales y dextrano.

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ES2955258 (29/11/2023) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
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