Patente nacional por "Pseudomonas atacamensis CECT 30419 mejoradora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de plantas."

Reivindicaciones:
+ ES-2902976_B21. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, microorganismo del grupo de las bacterias Gram género Pseudomonas, mejora dora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de plantas, c aracterizada por su capacidad de movilización de nutrientes estimulantes del proceso fotosintético de las plantas, de estimular el metabolismo adaptativo a estrés, modulando la respuesta oxidativa mediante inducción del metabolismo implicado en la eliminación de los radicales libres (ROS) producidos en la situación de estrés, de estimular el metabolismo secundario de compuestos fenólicos, actuando de forma directa en plantas de interés farmacológico y nutricional, y de mejorar las propiedades de los extractos de frutos de frambuesa y fresa como inhibidores de los enzimas relacionados con el síndrome metabólico, en concreto, a a-amilasa y a-glucosidasa, con un efecto hipoglucémico. 2. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 1, caracterizada por su capacidad de modificar el perfil de polifenoles en frutos rojos, como fresa y frambuesa, mejorando sus propiedades farmacológicas, nutricionales y de coloración. 3. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 1, para su aplicación en cualquier especie de plantas para mejorar el crecimiento y la producción vegetal. 4. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 1, para su aplicación en cualquier tipo de cultivo agrario o forestal, a fin de incrementar la producción de compuestos fenólicos del metabolismo secundario de interés farmacológico y nutricional. 5. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 4, para su aplicación en Hypericum perforatum (Hipericaceae) a fin de incrementar el contenido en compuestos fenólicos de interés farmacológico: hipericina y pseudohipericina. 6. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 2, para su aplicación en cualquier especie de los llamados rutos rojos o frutos del bosque, como fresa, frambuesa o mora, a fin de incrementar el contenido en compuestos fenólicos del metabolismo secundario. 7. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 1, para su aplicación en frutos de frambuesa y fresa, a fin de obtener extractos enriquecidos en compuestos fenólicos con capacidad mejorada para inhibir enzimas implicados en el metabolismo de azúcares en humanos, relacionadas con el síndrome metabólico, concretamente a-amilasa y a-glucosidasa. 8. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicaciones 3 a 7, formando parte de cualquier preparado bacteriano, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, y por cualquier medio disponible que ponga la bacteria en contacto con la semilla, el sistema radical o aéreo de las plantas. 9. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 8, en combinación con Pseudomonas fluorescens CECT 9015 y/o Pseudomonas putida CECT 9011 y/o Bacillus amyloliquefaciens CECT 9371, para su aplicación en cualquier especie herbácea o leñosa, para mejorar el crecimiento y la producción vegetal. 10. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 9, en combinación con Pseudomonas fluorescens CECT 9015 y/o Pseudomonas putida CECT 9011 y/o Bacillus amyloliquefaciens CECT 9371, para su aplicación en mora, frambuesa, tomate y melón, a fin de incrementar la producción.
+ ES-2902976_A11. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, microorganismo del grupo de las bacterias Gram género Pseudomonas, caracterizada por su capacidad de movilización de nutrientes estimulantes del proceso fotosintético de las plantas, mejoradora del crecimiento y la producción vegetal. 2. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, caracterizada por su capacidad estimulante del metabolismo adaptativo a estrés en especies vegetales, modulando la respuesta oxidativa mediante inducción del metabolismo implicado en la eliminación de los radicales libres (ROS) producidos en la situación de estrés, mejorando el crecimiento y la producción vegetal. 3. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, caracterizada por su capacidad estimulante del metabolismo secundario de compuestos fenólicos en especies vegetales, actuando de forma directa en plantas de interés farmacológico y nutricional. 4. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 3, caracterizada por su capacidad de modificar el perfil de polifenoles en frutos rojos, como fresa y frambuesa, mejorando sus propiedades farmacológicas, nutricionales y de coloración. 5. Cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, caracterizada por su capacidad de mejorar las propiedades de los extractos de frutos de frambuesa y fresa como inhibidores de los enzimas relacionados con el síndrome metabólico, en concreto, a a-amilasa y a-glucosidasa, con un efecto hipoglucémico. 6. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicaciones 1 y 2, para su aplicación en cualquier especie de plantas para mejorar el crecimiento y la producción vegetal. 7. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 3, para su aplicación en cualquier tipo de cultivo agrario o forestal, a fin de incrementar la producción de compuestos fenólicos del metabolismo secundario de interés farmacológico y nutricional. 8. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 7, para su aplicación en Hypericum perforatum (Hipericaceae) a fin de incrementar el contenido en compuestos fenólicos de interés farmacológico: hipericina y pseudohipericina. 9. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 4, para su aplicación en cualquier especie de los llamados frutos rojos o frutos del bosque, como fresa, frambuesa o mora, a fin de incrementar el contenido en compuestos fenólicos del metabolismo secundario. 10. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 5, para su aplicación en frutos de frambuesa y fresa, a fin de obtener extractos enriquecidos en compuestos fenólicos con capacidad mejorada para inhibir enzimas implicados en el metabolismo de azúcares en humanos, relacionadas con el síndrome metabólico, concretamente a-amilasa y a-glucosidasa. 11. Uso de la cepa bacteriana de la especie Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicaciones 6 a 10, formando parte de cualquier preparado bacteriano, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, y por cualquier medio disponible que ponga la bacteria en contacto con la semilla, el sistema radical o aéreo de las plantas. 12. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 11, en combinación con Pseudomonas fluorescens CECT 9015 y/o Pseudomonas putida CECT 9011 y/o Bacillus amyloliquefaciens CECT 9371, para su aplicación en cualquier especie herbácea o leñosa, para mejorar el crecimiento y la producción vegetal. 13. Uso de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis con número de depósito CECT 30419, según reivindicación 12, en combinación con Pseudomonas fluorescens CECT 9015 1 y/o Pseudomonas putida CECT 9011 y/o Bacillus amyloliquefaciens CECT 9371, para su aplicación en mora, frambuesa, tomate y melón, a fin de incrementar la producción. 1

Los productos y servicios protegidos por este registro son:
C12N 1/20 - A01N 63/27 - C12R 1/38

Descripciones:
+ ES-2902976_B2 Pseudomonas atacamensis CECT 30419 mejoradora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de plantas La presente invención se refiere a una cepa de Pseudomonas atacamensis (BBB003, código interno del laboratorio) para su uso en el tratamiento de plantas con el objeto de mejorar la producción mediante la movilización de nutrientes y adaptación al estrés, y de inducir la síntesis de compuestos fenólicos del metabolismo secundario con interés farmacológico y nutricional, además de mejorar la capacidad de los extractos de frutos de fresa y frambuesa para inhibir determinadas enzimas relacionadas con el síndrome metabólico. Esta cepa ha sido depositada con fines de patente en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , con fecha 29 de julio de 2021, donde se le ha asignado el número de depósito 30419. La CECT tiene su sede en el edificio de investigación de la Universidad de Valencia, sito en el campus de Burjassot (DP 4610.- Valencia, España) . CAMPO DE APLICACIÓN La invención se encuadra dentro de los campos de la agronomía, la biotecnología, la farmacología y los nuevos alimentos. Esta cepa bacteriana puede servir de base para la preparación de diferentes tipos de productos destinados al aumento de la producción y a la activación del metabolismo secundario de plantas, mejorando así la adaptación al estrés. Estos productos mejorarán la producción, y el contenido en bioactivos de naturaleza fenólica que puedan constituir principios activos de diversos medicamentos, mejorar la calidad de ciertos alimentos, su coloración, y mejorar la capacidad de adaptación de las plantas a estrés. ESTADO DE LA TÉCNICA La relevancia de cepas de distintas especies de Pseudomonas en agricultura está ampliamente demostrada, especialmente por su capacidad para estimular el crecimiento o proteger a las plantas como agentes de biocontrol (Sankari-Meena et al., 2019 Agriculture Application of Pseudomonas: A View on the Relative Antagonistic Potential Against Pests and Diseases) . El género Pseudomonas es común entre bacterias del suelo, y pueden ser atógenos oportunistas en animales y patógenos de plantas. Siguiendo la taxonomía del Manual Bergeys, edición marzo de 2001, esta bacteria se encuadra dentro del Dominio Bacteria, Phylum Proteobacteria, Clase gamma proteobacteria, Orden Pseudomonadales, Familia Pseudomonaceae. El género Pseudomonas es muy común en el sistema edáfico, y se ha descrito en repetidas ocasiones como bacteria protectora frente a distintas enfermedades de plantas. Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua. Entre otras funciones, estos pigmentos actúan como sideróforos (moléculas capaces de capturar el hierro del medio para el metabolismo del microorganismo) . La gran versatilidad metabólica del género se debe a un gran número de plásmidos que contienen operones inducibles para la síntesis de enzimas específicas que permitan catabolizar los compuestos presentes en el medio. La presencia de Pseudomonas sp. en la rizosfera de distintas plantas afecta de forma beneficiosa a su fisiología indicando que es muy posible su selección por la planta a nivel rizosférico. Los efectos de esta cepa sobre la fisiología de distintas plantas indican que la planta las selecciona en su beneficio. Por otra parte, el desarrollo de nuevas tecnologías de análisis genómico ha permitido discernir nuevas especies dentro de este género (Gomila et al., 2015 Front. Microbiol. | https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00214) , cuyos efectos beneficiosos para agricultura no han sido definidos. Desde que Migula describiera el género Pseudomonas en 1984, se han descrito hasta 255 especies (incluyendo sinónimos, http://www.bacterio.net/pseudomonas.html) . En 2010, Mulet y colaboradores definieron dos grupos dentro del género (Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens) sobre la base del análisis filogenético de las secuencias del gen 16S rRNA y tres genes `housekeeping (gyrB, rpoB and rpoD) comparando 107 cepas tipo. En este sentido, la especie Pseudomonas atacamensis ha sido recientemente descrita (Poblete-Morales et al., https://doi.org/10.1007/s10482-020-01427-0) y, sin embargo, no existen evidencias que demuestren efectos beneficiosos como promotoras del crecimiento vegetal de ninguna cepa de esta especie. Varias búsquedas retrospectivas de patentes realizadas a nivel mundial confirman dicha conclusión extraída de la consulta de literatura científica: la inexistencia de documentos de patente relativos a la especie bacteriana Pseudomonas atacamensis con capacidad movilizadora de nutrientes y de la adaptación a estrés, lo que la hace útil para mejorar el crecimiento de las plantas y la producción de los cultivos, y de Pseudomonas atacamensis como inductora del metabolismo secundario de compuestos fenólicos con interés farmacológico y nutricional. LA INVENCIÓN El objeto de la invención que aquí se describe y que, a la vista del estado de la técnica anterior, se entiende cumple con las condiciones de novedad y actividad inventiva necesarias para poder ser merecedora del derecho de patente, es el aislamiento y caracterización de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis BBB003, con número de depósito CECT 30419, que es un microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, con capacidad demostrada de movilizar nutrientes que mejoran el proceso fotosintético y el rendimiento metabólico, de mejora de la adaptación a condiciones de estrés, funcionalidades que redundan en un incremento del crecimiento y la producción vegetal, y de inducir la síntesis de compuestos fenólicos del metabolismo secundario en especies vegetales que, por la naturaleza de tales compuestos, resultan de interés farmacológico y/o nutricional, además de tener aplicación en la mejora del color de determinados frutos. Las características fisiológicas y el análisis genético de esta cepa permiten identificarla inequívocamente, diferenciándola de otras especies del género Pseudomonas Una vez aislada y caracterizada, se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto actividades bioquímicas indicadoras de su potencial capacidad de movilización de nutrientes y promoción del crecimiento vegetal. Estas fueron, producción de auxinas, degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, movilización de nitrógeno, solubilización de fosfato, calcio, y producción de sideróforos y quitinasas. Hasta el momento se han realizado experiencias consistentes en la inoculación directa de la cepa en planta modelo (Arabidopsis thaliana) donde ha inducido una disminución del estrés oxidativo disminuyendo la actividad superoxido dismutasa (SOD) , ascorbato peroxidasa (APX) y catalasa (CAT) , enzimas implicadas en la eliminación de radicales libres (ROS) , lo que indica una mejor adaptación al estrés. Asimismo, se ha encontrado que la planta responde a la cepa disminuyendo la actividad quitinasa. Cuando las plantas tratadas con BBB003 sufren un ataque del patógeno X.campestris, la incidencia de enfermedad es un 50% menor que en las no tratadas y disminuye el estrés oxidativo resentando niveles más bajos de SOD, APX y CAT, siendo esta disminución mucho más acusada en plantas sometidas a estrés. Se realizó otro experimento en Hypericum perforatum, familia Hypericaceae, conocida como Hierba de San Juan y caracterizada por contener principios activos de tipo fenólico con efecto antidepresivo. Este experimento en condiciones controladas reveló la capacidad de BBB003 para estimular el crecimiento y aumentar el contenido en hipericina y pseudohipericina un 200 y 40%, respectivamente. Por otro lado, se han realizado experimentos de elicitación con Pseudomonas atacamensis BBB003 puede también aplicarse a cualquier especie de plantas de las que constituyen los frutos rojos o frutos del bosque, como fresa, frambuesa, mora, arándano, o mirtillo, con el objeto de incrementar la producción y su contenido en compuestos fenólicos de interés farmacológico y nutricional. En particular, se ha ensayado la aplicación de la referida cepa bacteriana en frambuesa (Rubus idaeus var. Adelita) , especie en la que adelanta y aumenta la producción y modifica el perfil de polifenoles, mejorando el potencial beneficioso sobre la salud, concretamente, sobre el metabolismo y absorción de azúcares; En fresa (Fragaria x ananasa var. Fortuna) , la modificación de polifenoles resulta en un el aumento de antocianos representa una mejora del precio de mercado debido a una mejor coloración especialmente importante en las producciones tempranas lo que mejora el valor comercial de la fruta. En otra prueba de campo, se ha encontrado que Pseudomonas atacamensis combinada con Bacillus amyloliquefaciens CECT9371, también aumenta el contenido en antocianos en fresa. En mora, combinada con Bacillus amyloliquefaciens CECT9371 y Pseudomonas fluorescens CECT9015, anticipa y aumenta la producción y el contenido en antocianos, estimulando la fijación de CO2 y aumentando los pigmentos fotosintéticos. En pruebas de campo, se ha encontrado que Pseudomonas atacamensis combinada con otra cepa de Pseudomonas: P. putida CECT 9011, mejora la producción de melón y de tomate de industria, adelantando la maduración y aumentando el número de frutos; y en otra prueba de campo, se ha encontrado que combinada con dos cepas de Pseudomonas: P. fluorescens CECT 9015 y P. putida CECT 9011, también mejora la producción comercial de tomate de industria. Los referidos experimentos sobre el uso Pseudomonas atcamensis BBBB003 como mejorador de la producción, mejorador de la adaptación a estrés y elicitor del metabolismo secundario de compuestos fenólicos se exponen al final de la presente memoria, dentro del apartado forma de realización. La finalidad que se persigue, en definitiva, con esta invención y que constituye la ventaja técnica aportada con la misma, es disponer de una bacteria que mejore la producción agrícola y estimule el metabolismo secundario de compuestos fenólicos en plantas de interés farmacológico y nutricional, consiguiendo un doble efecto: por una parte, mejorar el contenido en antocianos de frutos rojos, y por tanto su valor comercial, y por otra parte, obtener la materia prima vegetal mejorada para obtener extractos que mejoran su efecto sobre los enzimas alfa-glucosidasa y alfa-amilasa, que pueden utilizarse para la mejora de los síntomas o prevención de síndrome metabólico. Además, por su efecto movilizador de nutrientes, mejora la producción vegetal por su capacidad para incrementar el proceso fotosintético mediante la mejora de fijación de carbono y el aumento de pigmentos fotosintéticos, asi como la movilización de nutrientes. En consecuencia, con la presente solicitud de patente se reivindica el uso de la cepa Pseudomonas atacamensis BBB003, para su aplicación en cualquier tipo de especie vegetal, formando parte de cualquier preparado, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, con el fin de incrementar la producción agrícola, mejorar la adaptación de las plantas a situaciones de estrés y estimular su metabolismo secundario de naturaleza fenólica. Sobre la base de estos efectos sobre las plantas, BBB003: 1) mejora la calidad del producto vegetales, bien para consumo directo o para la preparación de suplementos nutricionales o de extractos vegetales; 2) mejora la concentración de principios activos para la preparación extractos o diversos medicamentos; y 3) mejoren la producción vegetal (kg/ha) . GRAFICOS Al final de la presente memoria descriptiva se incluyen dos figuras con sendos gráficos de resultados de experimentos realizados. El gráfico de la Figura 1 muestra el perfil metabólico de la cepa (BIOLOG-ECO) , y el de la Figura 2, la capacidad de inhibición (IC50) de a-glucosidasa y a-amilasa bajo la nfluencia de extractos de frambuesa tratados con Pseudomonas atacamensis BBB003 y control en invierno (W) y primavera (S) . FORMA DE REALIZACIÓN La cepa del genero Pseudomonas que aquí se reseña se aisló estudiando la rizosfera de poblaciones naturales de Nicotiana glauca un transecto de la isla de Las Palmas de Gran Canaria (Islas Canarias) . Esta especie vegetal (Nicotiana glauca) se seleccionó por ser de la familia Solanaceae y por tener un metabolismo secundario activo. Los muestreos de rizosfera para el aislamiento de la cepa bacteriana se realizaron en poblaciones naturales de Nicotiana glauca en diciembre de 2017. Como resultado de dicho muestreo se coleccionaron 450 cepas entre las que se encontró Pseudomonas atacamensis (BBB003, código interno del laboratorio) . El aislamiento de dicha cepa se realizó en agar nutritivo (PCA) . En el laboratorio este microorganismo se mantiene con una elevada tasa de supervivencia en glicerol al 20% en caldo nutritivo (Pronadisa) a -80°C o en glicerol al 15% en agua a -20°C y se recuperan con facilidad en el medio de cultivo utilizado para el aislamiento tanto en fase sólida como en fase liquida a 28°C. Características morfológicas, bioquímicas y genéticas de Pseudomonas atacamensis BBB003.- Para la caracterización de las cepas se consideraron diferentes caracteres fenotípicos que se pormenorizan en esta memoria: (i) morfología de las colonias (ii) morfología de las células, (iii) biolog y pruebas bioquímicas iv) secuenciación del gen del ADN ribosomal correspondiente a la subunidad 16S. i) La morfología de las colonias a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) se especifica en la Tabla 1: Tabla 1 Creciendo en medio líquido (Caldo nutritivo Pronadisa) el color del medio cambia a amarillo desde la fase exponencial de crecimiento a la fase estacionaria de crecimiento. ii) Los caracteres morfológicos de Pseudomonas atacamensis BBB003 a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) corresponden a un bacilo Gram negativo. iii) Una vez aislada y caracterizada, con código de referencia interno BBB003, se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto el potencial PGPR de esta bacteria. Estas fueron, producción de auxinas (Brick et al., 1991 Appl. Environ. Microbiol., 57 (2) , 535; Sergeeva et al., 2007, Plant Soil, http://doi.org/10.1007/s11104-007-9314-5) , degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (Glick et al., 1995. http://doi.org/10.1139/m95-070) , movilización de nitrógeno, solubilización de fosfato (De Freitas et al., 1997. Biol. Fertil. Soils, 24 (4) , 358-364) , calcio (Tamilselvi et al., 2016. Front. plant sci, 7, 1828) , y producción de sideróforos (Alexander and Zuberer, 1991. Biol.Fertil.Soils, 12 (1) , 39-45) y quitinasas (Frandberg y Shunürer, 1998 Can.J. Microbiol. 44: 121-127) . El perfil metabólico (BIOLOG Eco, www.biolog.com/products-portfoliooverview/microbialcommunity-analysis-with-ecoplates/) de la cepa, mostrado en la Figura 1, indica que es capaz de degradar los ácidos carboxilicos málico, ácido galacturónico, ácido itacónico y ácido glucosamínico, y la degradación de manitol, xilosa, ácido glucónico g lactona y N-acetilglucosamina destacan entre los azúcares. Como fuentes de nitrógeno, utiliza putrescina, feniletilamina, serina, arginina, asparagina y ácido glicol-5 L-glutámico. Y finalmente como compuestos fenólicos utiliza el ácido hidroxibenzóico. iv) A continuación, se procedió a la caracterización taxonómica de BBB003 mediante el análisis genético de la cepa para su identificación, para ello se siguieron los siguientes pasos, amplificación PCR llevada a cabo usando los primers universales 27F (AGAGTTT GATCMT GGCTCAG) /1492R (T ACGGYT ACCTT GTT ACGACTT) , y secuenciación usando los primers 785F (GGATTAGATACCCTGGTA) /907R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT) . La comparación del ADN ribosomal 16S con las secuencias existentes en las bases de datos reveló una homología del 99, 86% con una cepa de Pseudomonas atacamensis. Experimentos demostrativos de la capacidad de Pseudomonas atacamensis como mejoradora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de compuestos fenólicos y de la capacidad de los extractos de fresa y frambuesa para inhibir enzimas relacionadas con el síndrome metabólico.- 1°. Experimento de inoculación directa de Pseudomonas atacamensis en planta modelo (Arabidopsis thaliana) . Experimento realizado en cámara de experimentación en condiciones controladas de luz humedad y temperatura sobre un total de 42 plantas y un N = 3, con un modelo de bloques aleatorios- se inoculó una suspensión celular de la cepa en plántulas pregerminadas de A.thaliana a las 2 y 5 semanas de la germinación. A las 6 semanas se midieron los parámetros fotosintéticos de fluorescencia (F0, Fv/Fm, PSII, NPQ) se cosecharon las plantas, y se pesaron y se analizaron las actividades enzimáticas relacionadas con el scavenging de ROS (SOD, APX, CAT) , y ciclo del Ascorbato glutatión (dehidroascorbato reductasa - DHR, monodehidroascorbato reductasa-MDHR, glutatión reductasa-GR) . El perfil metabólico de enzimas relacionados con el control del estrés oxidativo (ROS scavenging) inducido por la bacteria BBB003 consiste en una disminución de la actividad superóxido dismutasa (SOD) , Ascorbato peroxidasa (APX) y catalasa (CAT) , no alterándose las demás actividades, lo que indica un estado más relajado de la planta, reflejo de una mejor adaptación al medio. En un experimento similar, sometiendo a las plantas de arabidopsis estimuladas con BBB003 a una aplicación del patógeno foliar X.campestris a las 5 semanas de la germinación, se registró una protección del 50% con respecto a plantas control. En este caso, el perfil de los enzimas relacionados con el control de estrés oxidativo reflejó de nuevo una disminución de SOD, de APX y CAT, siendo en este caso una disminución mucho más acusada frente al control con patógeno. Esto indica una mejora de adaptación a estrés abiótico muy eficiente. Puesto que los mecanismos implicados en la adaptación a estrés iempre están mediados por radicales libres, este comportamiento se puede aplicar a cualquier tipo de estrés. 2°. Experimento de elicitación en plantas de Hypericum perforatum mediante aplicación directa de suspensiones bacterianas en la raíz. Se inoculó una suspensión bacteriana de la cepa BBB003 en la raíz de plántulas de Hypericum perforatum dos semanas después de la germinación y posteriormente, se inocularon cada dos semanas, durante 12 semanas. Se observó una inducción de la síntesis de los principios activos hipericina y pseudohipericina, logrando un incremento en la concentración de estos principios activos. 3°. Experimento de inoculación directa de Pseudomonas atacamensis en frambuesa (Rubus var. Lochness) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 400 plantas y n=3 para cada tratamiento (control y bacteria) , con un modelo experimental de bloques aleatorios. Se aplicaron suspensiones celulares de la cepa a nivel radical durante los 10 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes, de octubre a mayo. Se recogió la producción total y se determinaron dos momentos de muestreo, en plena fructificación, en los dos picos de producción enero y mayo. Se determinaron bioactivos (fenoles y antocianos) en frutos, nutricionales (pH, °Brix, y % ácido cítrico) ; y por último se han realizado medidas con los extractos metanólicos de fruto sobre la inhibición de enzimas relacionadas con la regulación de la glucosa (a-amilasa y a-glucosidasa) , enzimas relacionadas con el síndrome metabólico. Se registró un aumento en la producción de fruta (+16%) y anticipación en la producción, es decir, estimula la precocidad. Se registró i) una modificación en el perfil de fenoles con respecto al control en ambos momentos de muestreo, ii) un incremento de la capacidad de los extractos de fruto para inhibir la a-glucosidasa. El contenido de antocianos y fenoles en frutos de plantas inoculadas y control en los muestreos de invierno (W-winter) y primavera (S-spring) aparece en la Tabla 2; el IC50 de la a glucosidasa, y a-glucosidasa de ambos muestreos, tratados con Pseudomonas atacamensis (P) y control (C) aparecen en el gráfico de la Figura 2. En este gráfico, la abreviatura "RWC" corresponde a una muestra de extractos metanólicos de frambuesas cosechadas en invierno de plantas sin inocular, utilizada como control; "RWBBB003" corresponde a una muestra de extractos metanolicos de frambuesas cosechadas en invierno de plantas inoculadas con la cepa; "RSC" corresponde a una muestra de extractos metanolicos de frambuesas cosechadas en primavera de plantas sin inocular, utilizada como control; "RSBBB003" corresponde a una uestra de extractos metanolicos de frambuesas cosechadas en primavera de plantas inoculadas con la cepa; y las unidades de IC50 mg/ml se refieren a peso seco. La caracterización de los extractos se hizo de la siguiente manera: El contenido fenólico total del extracto se determina por el método colorimétrico de Singleton V.L., Rossi J.A. (1965) Colorimetr y of total phenolics with phosphomolibdicphosphotungstic acid reagent. Am J Enol Vitic 1016, 144-158, que se basa en la oxidación en medio básico de los grupos hidroxilos de los fenoles por el reactivo de Folin-Ciocalteu. Los resultados se expresan como mg de ácido gálico /g de extracto. De esta forma, los extractos obtenidos siguiendo los procesos que a continuación se detallan presentan un contenido fenólico total mínimo de 20 mg/g. El contenido de antocianos totales se determinó por el método diferencial de pH descrito por Giusti y Wrolstad (2001) , Anthocyanins Characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. In: Wrolstad RE, Acree TE, An H, Decker EA, Penner MH, Reid DS, Schwartz SJ, Shoemaker CF, Sporns P, Wiley J (ed) Current Protocols in Food Analytical Chemistr y . New York, pp F121-F129. doi: 10.1002/0471142913.faf0102s00, que evalúa la diferente absorbancia de los antocianos a distintos pH. Los resultados se expresan como mg equivalentes de cianidina- 3-glucósido por gramo de extracto fresco. Los resultados de la caracterización de los extractos metanolicos de frambuesas cosechadas en invierno (W) o primavera (S) , de plantas inoculadas con Pseudomonas atacamensis BBB003 (P) y controles sin inocular (C) , según este experimento quedan reflejados en la Tabla 2. Tabla 2 4°. Experimentos de inoculación directa de Pseudomonas atacamensis en fresa (Fragaria x ananasa var. Fortuna) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 700 plantas y n=3 para cada tratamiento (control y bacteria) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 15/16 y 16/17 con resultados similares. Se aplicaron suspensiones celulares de la cepa a nivel radical durante los 6 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes, de octubre a mayo. Se recogió la producción total y se determinaron dos momentos de muestreo, el de fructificación incipiente (enero) y plena (abril) . Se registró una mejora en los parámetros nutricionales (grados brix y pH) , así como en el contenido en compuestos fenólicos, especialmente antocianos, en ambos momentos de muestreo, tal y como muestran los datos de la Tabla 3. La Tabla 3 recoge los datos de caracterización de las fresas cosechadas en enero y marzo en plantas inoculadas con Pseudomonas atacamensis BBB003 y controles no inoculados. Las unidades de fenoles son mg equivalentes de ácido gálico/100 g peso fresco; las de flavonoles son mg equivalentes de catequina/100 g PF; las de antocianos son mg equivalentes de cianidina/100 g PF. El asterisco * indica diferencias significativas entre el control y BBB003 en las muestras de enero según el estadistico t-sudent; la almohadilla # indica diferencias significativas entre el control y BBB003 en las muestras de marzo según tstudent Tabla 3 5°. En un experimento similar al descrito en 4°, se aplicaron suspensiones de bacterias de Pseudomonas atacamensis BBB003, Bacillus amyloliquefaciens CECT9371 y una combinación de éstas. La Tabla 4 muestra los resultados de caracterización de las fresas cosechadas en enero y marzo en plantas inoculadas con Pseudomonas atacamensis BBB003 y controles no inoculados. Letras distintas indican la existencia de diferencias significativas (p<0, 05) según ANOVA y LSD. Se registró de nuevo una mejora en el contenido en antocianos (+21%) con BBB003, similar a la de Bacillus amyloliquefaciens CECT9371, registrándose un efecto sinérgico confirmado por el test estadístico de Colby (1967, Weeds, Vol 15, no.1.:20-22) cuando se aplicaron ambas bacterias (+ 64%) . La caracterización de los extractos se hizo como se ha indicado en 3°) para fenoles y antocianos; los flavonoles, según el método colorimétrico de cloruro de aluminio de Zishen et al. (1999. Food Chem 64:555-559. doi: 20 10.1016/S0308-8146 (98) 00102-2) con modificaciones. Se expresa como mg equivalentes de catequina por 100 gramos de peso fresco. Tabla 4 Se prepararon y caracterizaron los extractos metanólicos con estas fresas como se ha descrito en 3° y se evaluó su capacidad para inhibir los enzimas a-amilasa y aglucosidasa, con los resultados mostrados en la Tabla 5. Se encontró un incremento del 17% en la capacidad de los frutos tratados con BBB003 para inhibir la a-glucosidasa y de un 10% para inhibir la a-amilasa. En este caso, la combinación de bacterias no tenía un efecto de mejora sobre la capacidad de inhibir los enzimas. Tabla 5 Esta tabla recoge valores respecto a peso seco de IC50 para a-glucosidasa y aamilasa bajo los efectos de extractos de fresa procedentes de plantas tratadas con Pseudomonas atacamensis BBB003, Bacillus amyloliquefaciens CECT9371 y ambas bacterias. Letras distintas indican la existencia de diferencias significativas (p<0, 05) según ANOVA y LSD. 6°. Experimentos de aplicación de formulados que contienen Pseudomonas atacamensis en combinación con otras cepas (Bacillus amyloliquefaciens CECT 9371 y Pseudomonas fluorescens CECT 9015) en mora (Rubus sp. Loch Ness) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 120 plantas y n=3 para cada tratamiento (control y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 1920. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 5 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes de noviembre a abril, (10 aplicaciones) . Se midió la fotosíntesis, (fluorescencia y fijación de CO2) , encontrándose un aumento del quenching fotoquímico (OPSII) y un aumento en la fijación de CO2, que se concretó en una mayor producción. Se analizaron los pigmentos fotosintéticos según Harmut et al, 2001 (Harmut, K. Lichtenthaler and Claus Buschmann. Extraction of Photosynthetic Tissues: Chlorophylls and Carotenoids. Current Protocols in Food Analytical Chemistr y F.4.2.1- F.4.2.1.) Se recogió la producción total. Se registró una mejora en la producción del 18, 3%, así como un adelanto en la misma (precocidad) , de gran valor comercial. 7°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas putida CECT 9011 e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en melón (Cucumis melo, var. Piel de sapo Gran Riado) a cielo abierto. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 360 plantas y n=3, cada replica constituida por 40 plantas, para cada tratamiento (control, abono base y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 19/20. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 3 meses que dura el ciclo de producción, una vez al mes a razón de 1 kg/ha, (3 aplicaciones) . Se recogió la producción total, y se registró una mejora del 36, 9%, aumentando el tamaño y número de frutos con respecto al control y al abono base. 8°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas putida CECT 9011 e hidrolizado proteico omo abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en tomate de industria (Solanum lycopersicum, tomate de industria var. Malpica F1) a cielo abierto. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 360 plantas y n=3, cada replica constituida por 40 plantas, para cada tratamiento (control, abono base y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 1920. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 4 meses que dura el ciclo de producción, una vez al mes a razón de 1 kg/ha, (4 aplicaciones) . Se recogió la producción total. Se registró una mejora en la producción del 16%, aumentando el número de frutos con respecto al control y al abono base. 9°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas fluorescens CECT 9015 y Pseudomonas putida CECT 9011 (e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en tomate de industria (Solanum lycopersicum, tomate de industria var. Malpica F1) a cielo abierto. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 360 plantas y n=3, cada réplica constituida por 40 plantas, para cada tratamiento (control, abono base y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 19/20. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 4 meses que dura el ciclo de producción, una vez al mes a razón de 1 kg/ha, (4 aplicaciones) . Se recogió la producción total, y se registró una mejora del 14%, aumentando el número de frutos con respecto al control y al abono base. 10°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas fluorescens CECT 9015 e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en mandarino, var. Orogrande. El ensayo se realizó en 310 árboles, y se aplicó el producto en la mitad a una dosis de 250 g/ha, una vez al mes desde abril hasta la recolección en noviembre (8 aplicaciones) . Se encontró una mejora en los grados brix de las mandarinas del 10, 76% con respecto al control, representando una mejora comercial de la fruta. 11°. Experimentos de aplicación directa de Pseudomonas atacamensis en tomate cherr y . El ensayo se realizó en 140 plantas, en macetas con turba/arena, durante 4 meses. El diseño experimental contempla las variables: lugar de aplicación (raíz/hojas) , frecuencia (1 o 2 veces al mes) , y densidad bacteriana (107, 108 ufc/ml) ; cada tratamiento 3 réplicas de 5 plantas cada una, además del control no tratado. Se cosecharon los tomates desde el primer ramillete al 7°, se pesaron y se determinaron los grados brix. Se encontró una mejora n los grados brix con respecto al control, siendo el tratamiento más efectivo para el aumento de grados brix 108 vía radical, una vez al mes, aunque también mejora con respecto al control 10e8 vía foliar, una vez al mes. Con respecto al aumento de producción, la aplicación vía radical consigue un aumento del 35% en el peso de los tomates. APLICACIÓN INDUSTRIAL Dadas las propiedades arriba apuntadas de Pseudomonas atacamensis BBB003 puede ser utilizada con objeto de aumentar la producción vegetal por su capacidad para incrementar el proceso fotosintético mediante la mejora de fijación de carbono y el aumento de pigmentos fotosintéticos y la movilización de nutrientes. También mejora su rendimiento metabólico incrementando el contenido en compuestos fenólicos en especies vegetales de interés farmacológico y alimentario, cuya aplicación sería obtener mayor cantidad de principios activos y/o nuevos alimentos con un contenido estandarizado en fenoles, como frutos del bosque con mayor contenido en antocianos, teniendo también aplicación como mejorador de la adaptación de las plantas a estrés.
+ ES-2902976_A1 Pseudomonas atacamensis BBB003 mejoradora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de compuestos fenólicos y de la capacidad de los extractos de fresa y frambuesa para inhibir enzimas relacionadas con el síndrome metabólico La presente invención se refiere a una cepa de Pseudomonas atacamensis (BBB003, código interno del laboratorio) para su uso en el tratamiento de plantas con el objeto de mejorar la producción mediante la movilización de nutrientes y adaptación al estrés, y de inducir la síntesis de compuestos fenólicos del metabolismo secundario con interés farmacológico y nutricional, además de mejorar la capacidad de los extractos de frutos de fresa y frambuesa para inhibir determinadas enzimas relacionadas con el síndrome metabólico. Esta cepa ha sido depositada con fines de patente en la Colección Española de Cultivos Tipo (CECT) , con fecha 29 de julio de 2021, donde se le ha asignado el número de depósito 30419. La CECT tiene su sede en el edificio de investigación de la Universidad de Valencia, sito en el campus de Burjassot (DP 4610.- Valencia, España) . CAMPO DE APLICACIÓN.- La invención se encuadra dentro de los campos de la agronomía, la biotecnología, la farmacología y los nuevos alimentos. Esta cepa bacteriana puede servir de base para la preparación de diferentes tipos de productos destinados al aumento de la producción y a la activación del metabolismo secundario de plantas, mejorando así la adaptación al estrés. Estos productos mejorarán la producción, y el contenido en bioactivos de naturaleza fenólica que puedan constituir principios activos de diversos medicamentos, mejorar la calidad de ciertos alimentos, su coloración, y mejorar la capacidad de adaptación de las plantas a estrés. ESTADO DE LA TÉCNICA. - La relevancia de cepas de distintas especies de Pseudomonas en agricultura está ampliamente demostrada, especialmente por su capacidad para estimular el crecimiento o proteger a las plantas como agentes de biocontrol (Sankari-Meena et al., 2019 Agriculture Application of Pseudomonas: A View on the Relative Antagonistic Potential Against Pests and Diseases) . El género Pseudomonas es común entre bacterias del suelo, y pueden ser patógenos oportunistas en animales y patógenos de plantas. Siguiendo la taxonomía del Manual Bergeys, edición marzo de 2001, esta bacteria se encuadra dentro del Dominio Bacteria, Phylum Proteobacteria, Clase gamma proteobacteria, Orden Pseudomonadales, Familia Pseudomonaceae. El género Pseudomonas es muy común en el sistema edáfico, y se ha descrito en repetidas ocasiones como bacteria protectora frente a distintas enfermedades de plantas. Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarillo-verdosos fácilmente solubles en agua. Entre otras funciones, estos pigmentos actúan como sideróforos (moléculas capaces de capturar el hierro del medio para el metabolismo del microorganismo) . La gran versatilidad metabólica del género se debe a un gran número de plásmidos que contienen operones inducibles para la síntesis de enzimas específicas que permitan catabolizar los compuestos presentes en el medio. La presencia de Pseudomonas sp. en la rizosfera de distintas plantas afecta de forma beneficiosa a su fisiología indicando que es muy posible su selección por la planta a nivel rizosférico. Los efectos de esta cepa sobre la fisiología de distintas plantas indican que la planta las selecciona en su beneficio. Por otra parte, el desarrollo de nuevas tecnologías de análisis genómico ha permitido discernir nuevas especies dentro de este género (Gomila et al., 2015 Front. Microbiol. | https://doi.org/10.3389/fmicb.2015.00214) , cuyos efectos beneficiosos para agricultura no han sido definidos. Desde que Migula describiera el género Pseudomonas en 1984, se han descrito hasta 255 especies (incluyendo sinónimos, http://www.bacterio.net/pseudomonas.html) . En 2010, Mulet y colaboradores definieron dos grupos dentro del género (Pseudomonas aeruginosa y Pseudomonas fluorescens) sobre la base del análisis filogenético de las secuencias del gen 16S rRNA y tres genes `housekeeping (gyrB, rpoB and rpoD) comparando 107 cepas tipo. En este sentido, la especie Pseudomonas atacamensis ha sido recientemente descrita (Poblete-Morales et al., https://doi.org/10.1007/s10482-020-01427-0) y, sin embargo, no existen evidencias que demuestren efectos beneficiosos como promotoras del crecimiento vegetal de ninguna cepa de esta especie. Varias búsquedas retrospectivas de patentes realizadas a nivel mundial confirman dicha conclusión extraída de la consulta de literatura científica: la inexistencia de documentos de patente relativos a la especie bacteriana Pseudomonas atacamensis con capacidad movilizadora de nutrientes y de la adaptación a estrés, lo que la hace útil para ejorar el crecimiento de las plantas y la producción de los cultivos, y de Pseudomonas atacamensis como inductora del metabolismo secundario de compuestos fenólicos con interés farmacológico y nutricional. LA INVENCIÓN.- El objeto de la invención que aquí se describe y que, a la vista del estado de la técnica anterior, se entiende cumple con las condiciones de novedad y actividad inventiva necesarias para poder ser merecedora del derecho de patente, es el aislamiento y caracterización de la cepa bacteriana Pseudomonas atacamensis BBB003, con número de depósito CECT 30419, que es un microorganismo del grupo de las bacterias Gram -, género Pseudomonas, con capacidad demostrada de movilizar nutrientes que mejoran el proceso fotosintético y el rendimiento metabólico, de mejora de la adaptación a condiciones de estrés, funcionalidades que redundan en un incremento del crecimiento y la producción vegetal, y de inducir la síntesis de compuestos fenólicos del metabolismo secundario en especies vegetales que, por la naturaleza de tales compuestos, resultan de interés farmacológico y/o nutricional, además de tener aplicación en la mejora del color de determinados frutos. Las características fisiológicas y el análisis genético de esta cepa permiten identificarla inequívocamente, diferenciándola de otras especies del género Pseudomonas Una vez aislada y caracterizada, se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto actividades bioquímicas indicadoras de su potencial capacidad de movilización de nutrientes y promoción del crecimiento vegetal. Estas fueron, producción de auxinas, degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato, movilización de nitrógeno, solubilización de fosfato, calcio, y producción de sideróforos y quitinasas. Hasta el momento se han realizado experiencias consistentes en la inoculación directa de la cepa en planta modelo (Arabidopsis thaliana) donde ha inducido una disminución del estrés oxidativo disminuyendo la actividad superoxido dismutasa (SOD) , ascorbato peroxidasa (APX) y catalasa (CAT) , enzimas implicadas en la eliminación de radicales libres (ROS) , lo que indica una mejor adaptación al estrés. Asimismo, se ha encontrado que la planta responde a la cepa disminuyendo la actividad quitinasa. Cuando las plantas tratadas con BBB003 sufren un ataque del patógeno X.campestris, la incidencia de enfermedad es un 50% menor que en las no tratadas y disminuye el estrés oxidativo resentando niveles más bajos de SOD, APX y CAT, siendo esta disminución mucho más acusada en plantas sometidas a estrés. Se realizó otro experimento en Hypericum perforatum, familia Hypericaceae, conocida como Hierba de San Juan y caracterizada por contener principios activos de tipo fenólico con efecto antidepresivo. Este experimento en condiciones controladas reveló la capacidad de BBB003 para estimular el crecimiento y aumentar el contenido en hipericina y pseudohipericina un 200 y 40%, respectivamente. Por otro lado, se han realizado experimentos de elicitación con Pseudomonas atacamensis BBB003 puede también aplicarse a cualquier especie de plantas de las que constituyen los frutos rojos o frutos del bosque, como fresa, frambuesa, mora, arándano, o mirtillo, con el objeto de incrementar la producción y su contenido en compuestos fenólicos de interés farmacológico y nutricional. En particular, se ha ensayado la aplicación de la referida cepa bacteriana en frambuesa (Rubus idaeus var. Adelita) , especie en la que adelanta y aumenta la producción y modifica el perfil de polifenoles, mejorando el potencial beneficioso sobre la salud, concretamente, sobre el metabolismo y absorción de azúcares; En fresa (Fragaria x ananasa var. Fortuna) , la modificación de polifenoles resulta en un el aumento de antocianos representa una mejora del precio de mercado debido a una mejor coloración especialmente importante en las producciones tempranas lo que mejora el valor comercial de la fruta. En otra prueba de campo, se ha encontrado que Pseudomonas atacamensis combinada con Bacillus amyloliquefaciens CECT9371, también aumenta el contenido en antocianos en fresa. En mora, combinada con Bacillus amyloliquefaciens CECT9371 y Pseudomonas fluorescens CECT9015, anticipa y aumenta la producción y el contenido en antocianos, estimulando la fijación de CO2 y aumentando los pigmentos fotosintéticos. En pruebas de campo, se ha encontrado que Pseudomonas atacamensis combinada con otra cepa de Pseudomonas: P. putida CECT 9011, mejora la producción de melón y de tomate de industria, adelantando la maduración y aumentando el número de frutos; y en otra prueba de campo, se ha encontrado que combinada con dos cepas de Pseudomonas: P. fluorescens CECT 9015 y P. putida CECT 9011, también mejora la producción comercial de tomate de industria. Los referidos experimentos sobre el uso Pseudomonas atcamensis BBBB003 como mejorador de la producción, mejorador de la adaptación a estrés y elicitor del metabolismo secundario de compuestos fenólicos se exponen al final de la presente memoria, dentro del apartado forma de realización. La finalidad que se persigue, en definitiva, con esta invención y que constituye la ventaja técnica aportada con la misma, es disponer de una bacteria que mejore la producción agrícola y estimule el metabolismo secundario de compuestos fenólicos en plantas de interés farmacológico y nutricional, consiguiendo un doble efecto: por una parte, mejorar el contenido en antocianos de frutos rojos, y por tanto su valor comercial, y por otra parte, obtener la materia prima vegetal mejorada para obtener extractos que mejoran su efecto sobre los enzimas alfa-glucosidasa y alfa-amilasa, que pueden utilizarse para la mejora de los síntomas o prevención de síndrome metabólico. Además, por su efecto movilizador de nutrientes, mejora la producción vegetal por su capacidad para incrementar el proceso fotosintético mediante la mejora de fijación de carbono y el aumento de pigmentos fotosintéticos, asi como la movilización de nutrientes. En consecuencia, con la presente solicitud de patente se reivindica el uso de la cepa Pseudomonas atacamensis BBB003, para su aplicación en cualquier tipo de especie vegetal, formando parte de cualquier preparado, ya sea individualmente o en combinación con otros organismos, con el fin de incrementar la producción agrícola, mejorar la adaptación de las plantas a situaciones de estrés y estimular su metabolismo secundario de naturaleza fenólica. Sobre la base de estos efectos sobre las plantas, BBB003: 1) mejora la calidad del producto vegetales, bien para consumo directo o para la preparación de suplementos nutricionales o de extractos vegetales; 2) mejora la concentración de principios activos para la preparación extractos o diversos medicamentos; y 3) mejoren la producción vegetal (kg/ha) . GRAFICOS.- Al final de la presente memoria descriptiva se incluyen dos figuras con sendos gráficos de resultados de experimentos realizados. El gráfico de la Figura 1 muestra el perfil metabólico de la cepa (BIOLOG-ECO) , y el de la Figura 2, la capacidad de inhibición (IC50) de a-glucosidasa y a-amilasa bajo la nfluencia de extractos de frambuesa tratados con Pseudomonas atacamensis BBB003 y control en invierno (W) y primavera (S) . FORMA DE REALIZACIÓN.- La cepa del genero Pseudomonas que aquí se reseña se aisló estudiando la rizosfera de poblaciones naturales de Nicotiana glauca un transecto de la isla de Las Palmas de Gran Canaria (Islas Canarias) . Esta especie vegetal (Nicotiana glauca) se seleccionó por ser de la familia Solanaceae y por tener un metabolismo secundario activo. Los muestreos de rizosfera para el aislamiento de la cepa bacteriana se realizaron en poblaciones naturales de Nicotiana glauca en diciembre de 2017. Como resultado de dicho muestreo se coleccionaron 450 cepas entre las que se encontró Pseudomonas atacamensis (BBB003, código interno del laboratorio) . El aislamiento de dicha cepa se realizó en agar nutritivo (PCA) . En el laboratorio este microorganismo se mantiene con una elevada tasa de supervivencia en glicerol al 20% en caldo nutritivo (Pronadisa) a -80°C o en glicerol al 15% en agua a -20°C y se recuperan con facilidad en el medio de cultivo utilizado para el aislamiento tanto en fase sólida como en fase liquida a 28°C. Características morfológicas, bioquímicas y genéticas de Pseudomonas atacamensis BBB003.- Para la caracterización de las cepas se consideraron diferentes caracteres fenotípicos que se pormenorizan en esta memoria: (i) morfología de las colonias (ii) morfología de las células, (iii) biolog y pruebas bioquímicas iv) secuenciación del gen del ADN ribosomal correspondiente a la subunidad 16S. i) La morfología de las colonias a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) se especifica en la Tabla 1: Tabla 1 Creciendo en medio líquido (Caldo nutritivo Pronadisa) el color del medio cambia a amarillo desde la fase exponencial de crecimiento a la fase estacionaria de crecimiento. ii) Los caracteres morfológicos de Pseudomonas atacamensis BBB003 a las 24 h de incubación a 28° en agar para métodos estándar (PCA) corresponden a un bacilo Gram negativo. iii) Una vez aislada y caracterizada, con código de referencia interno BBB003, se realizaron diversas pruebas para poner de manifiesto el potencial PGPR de esta bacteria. Estas fueron, producción de auxinas (Brick et al., 1991 Appl. Environ. Microbiol., 57 (2) , 535; Sergeeva et al., 2007, Plant Soil, http://doi.org/10.1007/s11104-007-9314-5) , degradación de 1-aminociclopropano-1-carboxilato (Glick et al., 1995. http://doi.org/10.1139/m95-070) , movilización de nitrógeno, solubilización de fosfato (De Freitas et al., 1997. Biol. Fertil. Soils, 24 (4) , 358-364) , calcio (Tamilselvi et al., 2016. Front. plant sci, 7, 1828) , y producción de sideróforos (Alexander and Zuberer, 1991. Biol.Fertil.Soils, 12 (1) , 39-45) y quitinasas (Frandberg y Shunürer, 1998 Can.J. Microbiol. 44: 121-127) . El perfil metabólico (BIOLOG Eco, www.biolog.com/products-portfoliooverview/microbialcommunity-analysis-with-ecoplates/) de la cepa, mostrado en la Figura 1, indica que es capaz de degradar los ácidos carboxilicos málico, ácido galacturónico, ácido itacónico y ácido glucosamínico, y la degradación de manitol, xilosa, ácido glucónico g lactona y N-acetilglucosamina destacan entre los azúcares. Como fuentes de nitrógeno, utiliza putrescina, feniletilamina, serina, arginina, asparagina y ácido glicol-5 L-glutámico. Y finalmente como compuestos fenólicos utiliza el ácido hidroxibenzóico. iv) A continuación, se procedió a la caracterización taxonómica de BBB003 mediante el análisis genético de la cepa para su identificación, para ello se siguieron los siguientes pasos, amplificación PCR llevada a cabo usando los primers universales 27F (AGAGTTT GATCMT GGCTCAG) /1492R (T ACGGYT ACCTT GTT ACGACTT) , y secuenciación usando los primers 785F (GGATTAGATACCCTGGTA) /907R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT) . La comparación del ADN ribosomal 16S con las secuencias existentes en las bases de datos reveló una homología del 99, 86% con una cepa de Pseudomonas atacamensis. Experimentos demostrativos de la capacidad de Pseudomonas atacamensis como mejoradora de la producción vegetal y estimulante del metabolismo secundario de compuestos fenólicos y de la capacidad de los extractos de fresa y frambuesa para inhibir enzimas relacionadas con el síndrome metabólico.- 1°. Experimento de inoculación directa de Pseudomonas atacamensis en planta modelo (Arabidopsis thaliana) . Experimento realizado en cámara de experimentación en condiciones controladas de luz humedad y temperatura sobre un total de 42 plantas y un N = 3, con un modelo de bloques aleatorios- se inoculó una suspensión celular de la cepa en plántulas pregerminadas de A.thaliana a las 2 y 5 semanas de la germinación. A las 6 semanas se midieron los parámetros fotosintéticos de fluorescencia (F0, Fv/Fm, PSII, NPQ) se cosecharon las plantas, y se pesaron y se analizaron las actividades enzimáticas relacionadas con el scavenging de ROS (SOD, APX, CAT) , y ciclo del Ascorbato glutatión (dehidroascorbato reductasa - DHR, monodehidroascorbato reductasa-MDHR, glutatión reductasa-GR) . El perfil metabólico de enzimas relacionados con el control del estrés oxidativo (ROS scavenging) inducido por la bacteria BBB003 consiste en una disminución de la actividad superóxido dismutasa (SOD) , Ascorbato peroxidasa (APX) y catalasa (CAT) , no alterándose las demás actividades, lo que indica un estado más relajado de la planta, reflejo de una mejor adaptación al medio. En un experimento similar, sometiendo a las plantas de arabidopsis estimuladas con BBB003 a una aplicación del patógeno foliar X.campestris a las 5 semanas de la germinación, se registró una protección del 50% con respecto a plantas control. En este caso, el perfil de los enzimas relacionados con el control de estrés oxidativo reflejó de nuevo una disminución de SOD, de APX y CAT, siendo en este caso una disminución mucho más acusada frente al control con patógeno. Esto indica una mejora de adaptación a estrés abiótico muy eficiente. Puesto que los mecanismos implicados en la adaptación a estrés iempre están mediados por radicales libres, este comportamiento se puede aplicar a cualquier tipo de estrés. 2°. Experimento de elicitación en plantas de Hypericum perforatum mediante aplicación directa de suspensiones bacterianas en la raíz. Se inoculó una suspensión bacteriana de la cepa BBB003 en la raíz de plántulas de Hypericum perforatum dos semanas después de la germinación y posteriormente, se inocularon cada dos semanas, durante 12 semanas. Se observó una inducción de la síntesis de los principios activos hipericina y pseudohipericina, logrando un incremento en la concentración de estos principios activos. 3°. Experimento de inoculación directa de Pseudomonas atacamensis en frambuesa (Rubus var. Lochness) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 400 plantas y n=3 para cada tratamiento (control y bacteria) , con un modelo experimental de bloques aleatorios. Se aplicaron suspensiones celulares de la cepa a nivel radical durante los 10 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes, de octubre a mayo. Se recogió la producción total y se determinaron dos momentos de muestreo, en plena fructificación, en los dos picos de producción enero y mayo. Se determinaron bioactivos (fenoles y antocianos) en frutos, nutricionales (pH, °Brix, y % ácido cítrico) ; y por último se han realizado medidas con los extractos metanólicos de fruto sobre la inhibición de enzimas relacionadas con la regulación de la glucosa (a-amilasa y a-glucosidasa) , enzimas relacionadas con el síndrome metabólico. Se registró un aumento en la producción de fruta (+16%) y anticipación en la producción, es decir, estimula la precocidad. Se registró i) una modificación en el perfil de fenoles con respecto al control en ambos momentos de muestreo, ii) un incremento de la capacidad de los extractos de fruto para inhibir la a-glucosidasa. El contenido de antocianos y fenoles en frutos de plantas inoculadas y control en los muestreos de invierno (W-winter) y primavera (S-spring) aparece en la Tabla 2; el IC50 de la a glucosidasa, y a-glucosidasa de ambos muestreos, tratados con Pseudomonas atacamensis (P) y control (C) aparecen en el gráfico de la Figura 2. La caracterización de los extractos se hizo de la siguiente manera: El contenido fenólico total del extracto se determina por el método colorimétrico de Singleton V.L., Rossi J.A. (1965) Colorimetr y of total phenolics with phosphomolibdicphosphotungstic acid reagent. Am J Enol Vitic 1016, 144-158, que se basa 1 en la oxidación en medio básico de los grupos hidroxilos de los fenoles por el reactivo de Folin-Ciocalteu. Los resultados se expresan como mg de ácido gálico /g de extracto. De esta forma, los extractos obtenidos siguiendo los procesos que a continuación se detallan presentan un contenido fenólico total mínimo de 20 mg/g. El contenido de antocianos totales se determinó por el método diferencial de pH descrito por Giusti y Wrolstad (2001) , Anthocyanins Characterization and measurement with UV-visible spectroscopy. In: Wrolstad RE, Acree TE, An H, Decker EA, Penner MH, Reid DS, Schwartz SJ, Shoemaker CF, Sporns P, Wiley J (ed) Current Protocols in Food Analytical Chemistr y . New York, pp F121-F129. doi: 10.1002/0471142913.faf0102s00, que evalúa la diferente absorbancia de los antocianos a distintos pH. Los resultados se expresan como mg equivalentes de cianidina- 3-glucósido por gramo de extracto fresco. Los resultados de la caracterización de los extractos metanolicos de frambuesas cosechadas en invierno (W) o primavera (S) , de plantas inoculadas con Pseudomonas atacamensis BBB003 (P) y controles sin inocular (C) , según este experimento quedan reflejados en la Tabla 2. Tabla 2 4°. Experimentos de inoculación directa de Pseudomonas atacamensis en fresa (Fragaria x ananasa var. Fortuna) en invernaderos de producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 700 plantas y n=3 para cada tratamiento (control y bacteria) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 15/16 y 16/17 con resultados similares. Se aplicaron suspensiones celulares de la cepa a nivel radical durante los 6 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes, de octubre a mayo. Se recogió la producción total y se determinaron dos momentos de muestreo, el de fructificación incipiente (enero) y plena (abril) . Se registró una mejora en los parámetros nutricionales (grados brix y pH) , así como en el contenido en compuestos fenólicos, especialmente antocianos, en ambos momentos de muestreo, tal y como muestran los datos de la Tabla 3. La Tabla 3 recoge los datos de caracterización de las fresas cosechadas en enero y marzo en plantas inoculadas con Pseudomonas atacamensis BBB003 y controles no inoculados. Las unidades de fenoles son mg equivalentes de ácido gálico/100 g peso fresco; las de flavonoles son mg equivalentes de catequina/100 g PF; las de antocianos son mg equivalentes de cianidina/100 g PF. El asterisco * indica diferencias significativas entre el control y BBB003 en las muestras de enero según el estadistico t-sudent; la almohadilla # indica diferencias significativas entre el control y BBB003 en las muestras de marzo según tstudent Tabla 3 5°. En un experimento similar al descrito en 4°, se aplicaron suspensiones de bacterias de Pseudomonas atacamensis BBB003, Bacillus amyloliquefaciens CECT9371 y una combinación de éstas. La Tabla 4 muestra los resultados de caracterización de las fresas cosechadas en enero y marzo en plantas inoculadas con Pseudomonas atacamensis BBB003 y controles no inoculados. Letras distintas indican la existencia de diferencias significativas (p<0, 05) según ANOVA y LSD. Se registró de nuevo una mejora en el contenido en antocianos (+21%) con BBB003, similar a la de Bacillus amyloliquefaciens CECT9371, registrándose un efecto sinérgico confirmado por el test estadístico de Colby (1967, Weeds, Vol 15, no.1.:20-22) cuando se aplicaron ambas bacterias (+ 64%) . La caracterización de los extractos se hizo como se ha indicado en 3°) para fenoles y antocianos; los flavonoles, según el método colorimétrico de cloruro de aluminio de Zishen et al. (1999. Food Chem 64:555-559. doi: 20 10.1016/S0308-8146 (98) 00102-2) con odificaciones. Se expresa como mg equivalentes de catequina por 100 gramos de peso fresco. Tabla 4 Se prepararon y caracterizaron los extractos metanólicos con estas fresas como se ha descrito en 3° y se evaluó su capacidad para inhibir los enzimas a-amilasa y a-glucosidasa, con los resultados mostrados en la Tabla 5. Se encontró un incremento del 17% en la capacidad de los frutos tratados con BBB003 para inhibir la a-glucosidasa y de un 10% para inhibir la a-amilasa. En este caso, la combinación de bacterias no tenía un efecto de mejora sobre la capacidad de inhibir los enzimas. Tabla 5 Esta tabla recoge valores de IC50 para a-glucosidasa y a-amilasa bajo los efectos de extractos de fresa procedentes de plantas tratadas con Pseudomonas atacamensis BBB003, Bacillus amyloliquefaciens CECT9371 y ambas bacterias. Letras distintas indican la existencia de diferencias significativas (p<0, 05) según ANOVA y LSD. 6°. Experimentos de aplicación de formulados que contienen Pseudomonas atacamensis en combinación con otras cepas (Bacillus amyloliquefaciens CECT 9371 y Pseudomonas fluorescens CECT 9015) en mora (Rubus sp. Loch Ness) en invernaderos de 1 producción. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 120 plantas y n=3 para cada tratamiento (control y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 1920. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 5 meses que dura el ciclo de producción, dos veces al mes de noviembre a abril, (10 aplicaciones) . Se midió la fotosíntesis, (fluorescencia y fijación de CO2) , encontrándose un aumento del quenching fotoquímico (OPSII) y un aumento en la fijación de CO2, que se concretó en una mayor producción. Se analizaron los pigmentos fotosintéticos según Harmut et al, 2001 (Harmut, K. Lichtenthaler and Claus Buschmann. Extraction of Photosynthetic Tissues: Chlorophylls and Carotenoids. Current Protocols in Food Analytical Chemistr y F.4.2.1- F.4.2.1.) Se recogió la producción total. Se registró una mejora en la producción del 18, 3%, así como un adelanto en la misma (precocidad) , de gran valor comercial. 7°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas putida CECT 9011 e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en melón (Cucumis melo, var. Piel de sapo Gran Riado) a cielo abierto. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 360 plantas y n=3, cada replica constituida por 40 plantas, para cada tratamiento (control, abono base y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 19/20. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 3 meses que dura el ciclo de producción, una vez al mes a razón de 1 kg/ha, (3 aplicaciones) . Se recogió la producción total, y se registró una mejora del 36, 9%, aumentando el tamaño y número de frutos con respecto al control y al abono base. 8°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas putida CECT 9011 e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en tomate de industria (Solanum lycopersicum, tomate de industria var. Malpica F1) a cielo abierto. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 360 plantas y n=3, cada replica constituida por 40 plantas, para cada tratamiento (control, abono base y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 1920. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 4 meses que dura el ciclo de producción, una vez al mes a razón de 1 kg/ha, (4 aplicaciones) . Se recogió la producción total. Se registró una mejora en la producción del 16%, aumentando el número de frutos con respecto al control y al abono base. 9°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas fluorescens CECT 9015 y Pseudomonas putida CECT 9011 (e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en tomate de industria (Solanum lycopersicum, tomate de industria var. Malpica F1) a cielo abierto. Experimento realizado en condiciones reales de producción en campo sobre un total de 360 plantas y n=3, cada réplica constituida por 40 plantas, para cada tratamiento (control, abono base y producto) , con un modelo experimental de bloques aleatorios; el experimento se realizó en la campaña 19/20. Se aplicó el formulado a nivel radical durante los 4 meses que dura el ciclo de producción, una vez al mes a razón de 1 kg/ha, (4 aplicaciones) . Se recogió la producción total, y se registró una mejora del 14%, aumentando el número de frutos con respecto al control y al abono base. 10°. Experimentos de aplicación de formulados (conteniendo otras cepas de Pseudomonas, concretamente Pseudomonas fluorescens CECT 9015 e hidrolizado proteico como abono base) que contienen Pseudomonas atacamensis en mandarino, var. Orogrande. El ensayo se realizó en 310 árboles, y se aplicó el producto en la mitad a una dosis de 250 g/ha, una vez al mes desde abril hasta la recolección en noviembre (8 aplicaciones) . Se encontró una mejora en los grados brix de las mandarinas del 10, 76% con respecto al control, representando una mejora comercial de la fruta. 11°. Experimentos de aplicación directa de Pseudomonas atacamensis en tomate cherr y . El ensayo se realizó en 140 plantas, en macetas con turba/arena, durante 4 meses. El diseño experimental contempla las variables: lugar de aplicación (raíz/hojas) , frecuencia (1 o 2 veces al mes) , y densidad bacteriana (107, 108 ufc/ml) ; cada tratamiento 3 réplicas de 5 plantas cada una, además del control no tratado. Se cosecharon los tomates desde el primer ramillete al 7°, se pesaron y se determinaron los grados brix. Se encontró una mejora en los grados brix con respecto al control, siendo el tratamiento más efectivo para el aumento de grados brix 108 vía radical, una vez al mes, aunque también mejora con respecto al control 10e8 vía foliar, una vez al mes. Con respecto al aumento de producción, la aplicación vía radical consigue un aumento del 35% en el peso de los tomates. APLICACIÓN INDUSTRIAL. - Dadas las propiedades arriba apuntadas de Pseudomonas atacamensis BBB003 puede ser utilizada con objeto de aumentar la producción vegetal por su capacidad para incrementar el proceso fotosintético mediante la mejora de fijación de carbono y el aumento 1 de pigmentos fotosintéticos y la movilización de nutrientes. También mejora su rendimiento metabólico incrementando el contenido en compuestos fenólicos en especies vegetales de interés farmacológico y alimentario, cuya aplicación sería obtener mayor cantidad de principios activos y/o nuevos alimentos con un contenido estandarizado en fenoles, como frutos del bosque con mayor contenido en antocianos, teniendo también aplicación como mejorador de la adaptación de las plantas a estrés. 1

Publicaciones:
ES2902976 (30/03/2022) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
ES2902976 (29/09/2022) - B2 Patente de invención con examen
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