Patente nacional por "PROCEDIMIENTO DE HIDRÓLISIS MEDIANTE BIOCATALIZADORES ENZIMÁTICOS SOPORTADOS"

Reivindicaciones:
+ ES-2925107_A11. Procedimiento de hidrólisis de oleínas caracterizado porque comprende realizar la hidrólisis con un biocatalizador soportado sobre un nanosoporte magnético anclado de forma no covalente a dicho nanosoporte. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además la optimización del pH de las oleínas a un pH comprendido entre 5 y 7. 3. Procedimiento según la reivindicación 2, que comprende: - disponer las oleínas con un pH comprendido entre 5 y 7, un disolvente polar y proceder en el siguiente orden: - neutralizar oleínas al pH óptimo del biocatalizador - añadir un disolvente polar, preferiblemente H2O, con el biocatalizador disperso. - generar una emulsión con una agitación comprendida entre 300-1000 rpm, preferiblemente 400 rpm. y llevar a cabo la reacción de hidrólisis. 4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura 50 y 65°C, preferiblemente 55°C. 5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la reacción se lleva a cabo en una emulsión con una agitación comprendida entre 100­ 1000 rpm, preferiblemente 400-800 rpm. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 o 5, en el que la cantidad de biocatalizador soportado está comprendida entre 0, 5 % y 1% de la suma de la masa del disolvente polar y oleínas. 7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la cantidad de biocatalizador soportado está comprendida en el intervalo de 0, 5- 1% del total de la mezcla de reacción. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 7, en el que el biocatalizador es una enzima proteica, preferentemente lipasa y más preferentemente la lipasa CALB. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 8, en el que el ratio entre las oleínas y disolvente polar es 1:1. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 9 en el que la reacción se lleva a cabo en un tiempo comprendido entre 15-30hr, preferentemente 24hr. 11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el soporte magnético son nanoestructuras magnéticas de Fe o de óxidos mixtos de Fe (III) y M (II) , siendo M (II) : Fe, Co, Ni, Cu, Zn. 12. Método de preparación de un biocatalizador soportado para llevar a cabo el procedimiento definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende las siguientes etapas: 1. preparación de un nanosoporte magnético funcionalizado, 2. anclaje no covalente del biocatalizador al nanosoporte magnético funcionalizado. 13. Método según la reivindicación anterior, en el que el nanosoporte magnético son nanoestructuras magnéticas basadas en óxidos de hierro y/o óxidos mixtos de hierro con M, donde M es Fe, Co, Ni, Cu, Zn. 14. Método según la reivindicación anterior, en el que sales de M (II) y Fe (III) como materia prima se disuelven en agua destilada dentro de un reactor en una proporción molar M (II) y Fe (III) 1:2. 15. Método según la reivindicación anterior, en el que se desgasifica y satura el medio de reacción con un gas inerte, preferentemente Argón. 16. Método según una de las reivindicaciones 12 a 15, en el que la mezcla de reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 2 y 90°C, preferentemente 90°C. 17. Método según una de las reivindicaciones 12 a 16, que comprende añadir un silano con un grupo de funcionalización con amino y/o hidroxilo y/o tiol terminales, preferentemente APTES. 18. Método según una de las reivindicaciones 12 a 17, que comprende añadir el silano y una base fuerte al mismo tiempo, en una disolución. 19. Método según la reivindicación anterior, en el que el silano se introduce con un exceso de silano respecto a M (II) comprendido entre 15 y 25% molar, preferentemente 20% en exceso molar respecto al M (II) , siendo M (II) : Fe, Co, Ni, Cu, Zn. 20. Método según una de las reivindicaciones 12 a 19, en el que el tamaño de las nanoestructuras magnéticas es de 6 a 20 nanómetros, preferentemente 9 nanómetros y, su radio hidrodinámico de 40 a 500 nanómetros, preferentemente 120 nanómetros. 21. Uso del método definido en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en la industrias química, cosmética, farmacéutica o alimentaria 22. Uso del método según la reivindicación anterior que comprende el reciclado de subproductos de origen vegetal, ácidos grasos de destilación, procedentes de los procesos de refino químico de aceites

Los productos y servicios protegidos por este registro son:
C12N 11/14 - C12P 7/64

Descripciones:
+ ES-2925107_A1 En la presente memoria el término oleína, es un término que se refiere a un compuesto o conjunto de compuestos de origen graso, donde el compuesto o compuestos mayoritarios son ésteres. Un tipo particular de oleínas son los aceites ácidos (aceites de carácter ácido) . En la presente memoria los términos "biocatalizador" y "enzima" son sinónimos y se usan de forma intercambiable. En la presente memoria el término "neutralización" se entiende como la aproximación o ajuste del pH de las oleínas al pH óptimo de actuación del biocatalizador. En la presente memoria "nanosoporte magnético" significa una nanoestructura con propiedades paramagnéticas y/o superparamagnéticas y/o ferromagnéticas y/o ferrimagnéticas. Los biocatalizadores son la herramienta fundamental de este proyecto. Por su elevado coste se plantea la necesidad de desarrollar un catalizador heterogéneo (soportado) , ara poder dar más usos al mismo, haciendo posible su recuperación del medio de reacción, con objeto de hacer el proceso de hidrólisis enzimática más competitivo. La presente invención divulga un procedimiento de hidrólisis de oleínas caracterizado porque comprende realizar la hidrólisis con un biocatalizador soportado sobre un nanosoporte magnético anclado de forma no covalente a dicho nanosoporte. De este modo, las interacciones predominantes son electrostáticas fuertes como: puentes de hidrógeno, dipolo-dipolo y dipolo-dipolo inducido. El procedimiento de hidrólisis de oleínas de la invención tiene lugar en emulsión y la hidrólisis ocurre en la interfase de un medio emulsionado. En una realización particular, dicho procedimiento de hidrólisis comprende, además, la optimización del pH de las oleínas. Dicho pH está comprendido entre 5 y 7, preferiblemente, 5, 5 y 5, 8, más preferiblemente 5, 5. Se puede utilizar cualquier base de Bronsted para optimizar dicho pH, por ejemplo, bases de metales alcalinos, de metales alcalinotérreos, térreos, e hidruros metálicos, y preferiblemente NaOH. En una realización particular, dicho procedimiento de hidrólisis comprende además la formación de una emulsión con un disolvente polar, preferiblemente un disolvente polar que no disuelva grasas, y más en particular H2O. El procedimiento de la presente invención según realizaciones particulares comprende: 1.- disponer las oleínas con un pH comprendido entre 5 y 7, preferiblemente entre 5, 5 y 5, 8, y un disolvente polar 2.- neutralizar oleínas al pH óptimo del biocatalizador 3.- añadir un disolvente polar, preferiblemente H2 O, con el biocatalizador disperso. generar una emulsión, por ejemplo, con una agitación comprendida entre 300-1000 rpm, preferiblemente 400 rpm, y llevar a cabo la reacción de hidrólisis. El disolvente polar que se utiliza en las etapas 1) y 3) es el mismo. La reacción de hidrólisis se realiza a una temperatura entre 50 y 65°C, preferiblemente 55°C. La cantidad de biocatalizador soportado necesaria para el procedimiento se calcula en base a la cantidad de disolvente polar y oleínas; y está comprendida entre 0, 5 % y 1% de la suma de la masa de del disolvente polar y oleínas. La cantidad de biocatalizador soportado comparado con la masa total de la mezcla total de reacción se puede considerar despreciable, de modo que si no se tiene en cuenta la cantidad de biocatalizador soportado en la mezcla, se puede decir - y así se considera en la presente memoria - que está comprendida en el intervalo de 0, 2 - 1%, preferiblemente entre 0, 5- 1 % del total de la mezcla de la reacción. La mezcla de reacción contiene las oleínas (grasa) y el disolvente polar (preferentemente, agua) (con el biocatalizador) , formando una emulsión. El biocatalizador es una enzima proteica, preferentemente lipasas y más preferentemente la lipasa CAL-B. El ratio entre las oleínas y el disolvente polar es cualquiera que genere una emulsión. Según realizaciones preferentes, el ratio entre las oleínas y disolvente polar es 1:1. La reacción de hidrólisis transcurre a una agitación comprendida entre 100 y 1000 revoluciones por minuto (rpm) , preferiblemente 400-800 rpm, por ejemplo, 700 rpm. El objetivo es que se genere un régimen turbulento en el reactor para que el área de interfase, en la que se lleva a cabo la reacción sea máxima. La reacción se lleva a cabo en un tiempo comprendido entre 15-30hr, preferentemente 24hr. Pasado el tiempo de reacción se rompe la emulsión por centrifugación, preferentemente a 10000 rpm. La fase orgánica/oleosa, al ser menos densa, y "estar arriba" se puede recoger con una pipeta (si el volumen de reacción es pequeño) o se puede separar con un embudo de decantación (si el volumen de reacción es grande) . El biocatalizador se recupera por decantación magnética de la fase acuosa aislada (La fase acuosa (que contiene el biocatalizador) se separa de la orgánica por centrifugación. Rota la emulsión con este proceso y separadas las fases (acuosa de la orgánica) , se procede a la separación del biocatalizador de la fase acuosa por decantación magnética y los sucesivos lavados con agua/EtOH (80:20) ) . La fase acuosa es la que contiene el biocatalizador. Una vez separada la fase orgánica de la acuosa, la fase acuosa se la ava, según realizaciones particulares, con agua/EtOH (80:20) . El intervalo de la proporción es, por ejemplo, agua/etanol 70:30 a 90:10. Según realizaciones particulares se pueden realizar 3 lavados (3X20 mL) . De estos lavados el biocatalizador se recupera por decantación magnética. Este biocatalizador está listo para llevar a cabo el siguiente ciclo de reacción. Para determinar el biocatalizador recuperado, según realizaciones particulares, se puede liofilizar y posteriormente se pesa. En el proceso de liofilización se añade manitol ( (2R, 3R, 4R, 5R) -Hexano-1, 2, 3, 4, 5, 6-hexol) con un agente de carga (Ejemplos de Agentes de carca por familia de compuestos; azúcares: manitol, lactosa, sucrosa, trehalosa, sorbitol, glucosa, rafinosa; aminoácidos: arginina, glicina, histidina; polímeros: dextrano, polietilenglicol) , se añade 1:1 (en masa) biocatalizador/manitol. Según realizaciones particulares, las condiciones de liofilización son 0, 02mbar, -80°C, 24h (mínimo) . Según realizaciones preferentes del procedimiento, el nanosoporte magnético son nanoestructuras de Fe o mixtas de Fe con Co, Ni, Cu, Zn, según las propiedades magnéticas deseadas: paramagnéticas y/o superparamagnéticas y/o ferromagnéticas y/o ferrimagnéticas. El siguiente esquema muestra una realización particular de la unión del biocatalizador al soporte y del procedimiento de hidrólisis de oleínas de la invención: M: Fe, Co, Ni, Cu, Zn Enz 32°C, 2h, 250 rpm Enz: Lipasa, CAL-B Hidrólisis Etq OEt Oleínas Enz donde M es: Fe, Co, Ni, Cu o Zn. Obtención de biocatalizadores soportados El método para la preparación del biocatalizador soportado se adapta a partir de protocolos descritos en la bibliografía con algunas modificaciones (C. G. C. M. Netto et al. Tetrahedron Asymmetr y 2009, 20, 2299; M. Bilal et al. International Journal of Biological Macromolecules 2018, 120, 2530; S. Nadar et al. International Journal of Biological Macromolecules 2018, 120, 2293; J. A. Donadelli et al. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2018, 161, 654; R. C. Rodrigues Biotechnology Advances 2019, 37, 746; M. Bilal et al. Coordination Chemistr y Reviews 2019, 388, 1) : El método de preparación del biocatalizador soportado comprende los siguientes pasos: 1. preparación de un nanosoporte magnético funcionalizado. 2. anclaje no covalente del enzima al nanosoporte magnético funcionalizado. Etapa 1: Preparación de un nanosoporte magnético funcionalizado El nanosoporte magnético está basado en óxidos de hierro y/o óxidos mixtos de hierro con M: Fe, Co, Ni, Cu, Zn. Para la preparación de un nanosoporte magnético basado en óxidos mixtos de hierro se parte de sales de M (II) y Fe (III) (por ejemplo, haluros) como materia prima en una proporción molar M (II) y Fe (III) 1:2. La materia prima (sales de M (II) y Fe (III) ) ) se disuelve en agua destilada dentro de un reactor. Se procede a desgasificar el medio de reacción y saturarlo con un gas inerte, preferentemente Argón. La mezcla anterior se lleva a una temperatura comprendida entre 2 y 90°C, preferentemente 90°C. A continuación, se añade una base fuerte junto al grupo de funcionalización. Preferentemente la base será de un elemento del grupo 1 (Na, Li, K) , y más preferentemente, hidróxido amónico. Preferentemente, el grupo de funcionalización será un silano con grupos hidroxilo, amino, tioles terminales, más preferente APTES (aminopropil-trietoxisilano) . El silano se introduce con un exceso de silano respecto a M (II) comprendido entre 15 y 25% molar, preferentemente 20% en exceso molar respecto al M (II) . Se observa un cambio de color de la mezcla a negro, lo que indica la formación de óxidos mixtos metálicos. La reacción tiene una duración comprendida entre 15 minutos y 3 horas, preferentemente 2 horas para la formación de nanoestructuras magnéticas. La reacción se lleva a cabo a una temperatura comprendida entre 2 y 100°C, preferentemente a 90°C. La reacción se lleva a cabo con una agitación comprendida entre 100 y 1000 rpm, preferentemente a 700 rpm. Pasado ese tiempo se lleva a cabo la purificación de las nanoestructuras magnéticas obtenidas, con lavados (por ejemplo, entre 2 y 6 lavados, preferentemente 3 lavados) de agua destilada o desionizada. Tras cada lavado se recuperan las nanoestructuras magnéticas mediante una decantación magnética o centrifugación y decantación magnética. Para nanoestructuras de tamaño menor a 10 nanómetros se ha utilizado disoluciones saturadas en NaCl para favorecer la decantación magnética. El tamaño de las nanoestructuras magnéticas es de 6 a 20 nanómetros, preferentemente 9 nanómetros y, su radio hidrodinámico de 40 a 500 nanómetros, preferentemente 120 nanómetros. El porcentaje de funcionalización con silano está comprendido entre 2 a 5% (con respecto a la masa de la nanoestructura magnética) en función del tamaño de la nanoestructura magnética. NH4OH, APTES, H20 Etq OEt m c i2 + FeCl3 - M: Fe, Co, Ni, Cu, Zn Etapa 2: Anclaje no covalente de la enzima al nanosoporte magnético funcionalizado. El biocatalizador está basado en la unión no covalente entre nanoestructuras magnéticas funcionalizadas con enzimas proteicas. Las interacciones entre soporteenzima son electrostáticas fuertes basadas en puentes de hidrógeno, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo inducido. Para ello, las nanoestructuras magnéticas funcionalizadas tienen grupos superficiales hidroxilo y/o amino y/o tiol. Las enzimas deben ser de origen proteico, preferentemente lipasas y más preferentemente CAL-B. En agua destilada se dispersan homogéneamente las nanoestructuras magnéticas. A continuación, se añade enzima al medio. La proporción enzima/ nanoestructura magnética está comprendida entre 1:1 a 0, 2:1, preferentemente 0, 2:1. El proceso de anclaje se lleva a cabo en agitación comprendida entre 100 y 500 rpm, preferentemente 250 rpm. El proceso de anclaje tiene una duración comprendida entre 1 y 24 horas, preferentemente 2 horas. El rendimiento del proceso de anclaje está comprendido entre 50% y mayor a 80%, siendo el rendimiento medio 80%. El radio hidrodinámico del biocatalizador obtenido está comprendido entre 200 nanómetros y 3000 nanómetros, preferentemente 250 nanómetros. La polidispersidad del biocatalizador está comprendida entre 0.3 y 0.5. EJEMPLOS DE REALIZACIÓN Anclaje no covalente de la enzima a un nanosoporte magnético funcionalizado Se pesan 0, 23335g de CAL-B en un matraz de fondo redondo. A continuación, se disuelve en 44 mL de agua. Proporción CAL-B/MNPs 200 pg/mg (donde M es Fe) a conseguir. Dispersión de MNPs 21, 39 mg MNPs/mL H2O, para que se cumpla la proporción se cogen 54, 55 mL de dispersión de nanopartículas magnéticas y se añaden a la disolución de CAL-B. Se añaden 95 mL de agua para diluir la mezcla, en forma de dispersión de CAL-B/MNPs. Esta mezcla se lleva a 32°C, y se mantiene durante 2 h agitando a 450 rpm, tiempo estipulado para que se produzca el anclaje no covalente de la enzima al nanosoporte magnético. Pasado este tiempo se lava con H2 O destilada (3X20mL) , para eliminar la enzima libre o no soportada. El rendimiento de anclaje fue de 78, 3%. El proceso de anclaje se lleva a una temperatura e de 32°C. El proceso de anclaje se lleva a cabo en agitación de 250 rpm. durante 2 horas. El rendimiento del proceso de anclaje está comprendido entre 50% y mayor a 80%, siendo el rendimiento medio 80%. Esquema del anclaje del biocatalizador al soporte: Enz M: Fe, Co, Ni, Cu, Zn Enz: Lipasa, CAL-B Comparación biocatalizador libre Vs biocatalizador soportado Para comparar la eficacia entre un biocatalizador libre y uno soportado se ha llevado a cabo un procedimiento de hidrólisis de residuos industriales (oleínas) - representados en el esquema siguiente como la acción del catalizador en un proceso de hidrólisis para la formación de un ácido graso y glicerina - a escala de laboratorio ilustrado en el esquema de reacción: M: Fe, Co, Ni, Cu, Zn Donde M para este ejemplo será Fe. Protocolo de la reacción de hidrólisis y recuperación del catalizador. En un matraz de fondo redondo se pesan 15 g de oleína. A continuación, se ajusta el pH a 5, 5 con una disolución de NaOH (0, 1M) . La oleína se mantiene a temperatura ambiente y bajo agitación (400 rpm) durante 15 minutos. En un vaso de precipitados se pesa 2, 23064 g de Biocatalizador/manitol (1:1 en masa) . A continuación, se añaden 15 mL de agua para disolver el biocatalizador y se mantiene bajo agitación (350 rpm) durante 5 minutos tiempo en el cual todo el sólido queda disperso en agua. A continuación, la oleína se lleva a la temperatura de reacción (55°C) , una vez alcanzada esta temperatura, se añade la dispersión de biocatalizador en agua. La mezcla se lleva a una agitación de 700 rpm, generándose así una emulsión entre ambas fases, de manera espontánea. La emulsión de reacción se mantiene durante 24 horas, a 55°C y una agitación de 700 rpm. Pasado el tiempo de reacción, se lleva la emulsión de reacción a temperatura ambiente. A continuación, este medio se somete a centrifugación (10000 rpm, 10 min, 4°C) , que rompa la emulsión y se produzca una separación de fases: orgánica (menor densidad) y acuosa (mayor densidad) . La fase acuosa, que contiene el biocatalizador, se aisla de la fase orgánica (oleosa) , retirando esta última con una pipeta pasteur. El biocatalizador ontenido en la fase acuosa se lava con una disolución de agua/etanol (80:20) 3X10 mL. Entre los lavados el biocatalizador se recupera por decantación magnética. Una vez lavado, el biocatalizador se somete a un proceso de liofilización (0, 02 mbar, -80°C, 24 h) , para ello se añade 1g de manitol como agente de carga. Una vez liofilizado el biocatalizador está listo para ser reutilizado en el siguiente ciclo de reacción. La proporción de oleínas frente a agua fue de 1:1 (rango Oleinas/agua desde 1:1, 5 a 1, 5:1) , y la proporción de biocatalizador libre o soportado fue de 0, 5% en peso respecto al peso total de la mezcla de reacción (el rango puede estar comprendido entre 0, 5%-1% en masa de biocatalizador con respecto a la mezcla de reacción) . La enzima CAL-B (Sigma-Aldrich) es nativa y para esta realización particular se empleó tanto de forma libre, como anclada no covalentemente a la superficie del sustrato. El procedimiento de hidrólisis se ha llevado a través de la formación de una emulsión oleína/agua/biocatalizador (400 rpm) . Intervalo de agitación de 300 rpm a 1000 rpm. El rendimiento de la reacción de hidrólisis se determinó mediante una valoración Acido-Base con fenolftaleína, como indicador. Se mide la acidez inicial de la mezcla y la acidez final, la diferencia son los moles de ácidos consumidos, es decir, el número moles de ácidos grasos que han liberado de las oleínas, como resultado de la acción del enzima. Las condiciones de hidrólisis y rendimiento de reacción se muestran en la tabla siguiente: Ensayo de recuperación y reutilización del biocatalizador soportado A continuación, se muestra una tabla con los rendimientos en el procedimiento de hidrólisis (mostrado anteriormente) del biocatalizador soportado (NPs MFe2O4 -CALB) tras realizar los ensayos de recuperación y reutilización del mismo: Los tres ciclos son un ejemplo, no significa que el catalizador no sea activo para ciclos sucesivos. Simplemente demuestra que el catalizador es recuperable y activo tras su reciclaje, por tanto empleable en sucesivos ciclos de reacción. El protocolo de recuperación y reutilización del biocatalizador se basa en una serie de etapas concatenadas: la ruptura de la emulsión por centrifugación, recuperación del biocatalizador en la fase acuosa, decantación magnética y limpieza del catalizador. El proceso de centrifugación se lleva a cabo preferentemente a 10000 rpm, durante 10 minutos. Pasado ese periodo de tiempo, el biocatalizador es aislado en la fase acuosa. El biocatalizador es recuperado por decantación magnética, en presencia de un campo magnético. El protocolo de limpieza del biocatalizador antes de cada reutilización fue de 3 lavados de 20 mL con una disolución de EtOH:H2O (20:80) y decantación magnética del biocatalizador. Una vez lavado se adiciona manitol (en proporción 1:1 respecto a la cantidad de catalizador recuperada) como agente de carga para un proceso de secado por liofilización. El proceso de liofilización se lleva a cabo a una presión comprendida entre 0, 02 y 2 mbar, preferentemente de 0, 02 mbar, a una temperatura de -80°C, durante 24 horas. Tras el proceso de liofilización el biocatalizador está listo para ser reutilizado.

Publicaciones:
ES2925107 (13/10/2022) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
Eventos:
En fecha 29/03/2021 se realizó Registro Instancia de Solicitud
En fecha 29/03/2021 se realizó Admisión a Trámite
En fecha 29/03/2021 se realizó 1001P_Comunicación Admisión a Trámite
En fecha 19/04/2021 se realizó Superado examen de oficio
En fecha 28/07/2021 se realizó Realizado IET
En fecha 29/07/2021 se realizó 1109P_Comunicación Traslado del IET
En fecha 13/10/2022 se realizó Publicación Solicitud
En fecha 13/10/2022 se realizó Publicación Folleto Solicitud con IET (A1)
En fecha 12/01/2023 se realizó PETEX_Petición de examen sustantivo
En fecha 12/01/2023 se realizó 5215P_Observaciones del solicitante al IET, Opinión Escrita y/o alegaciones a observaciones de terceros
En fecha 30/01/2023 se realizó Validación petición y/o pago de examen sustantivo conforme
Pagos:
29/03/2021 - Pago Tasas IET