Patente nacional por "Nanopartículas mesoporosas de sílice y su uso en la captación de inmunoglobulinas"

Reivindicaciones:
+ ES-2959709_A11. Una nanopartícula mesoporosa de sílice que comprende una proteína G o una proteína A anclada de forma covalente, donde el tamaño medio de los poros de la nanopartícula es igual o superior a l O n m d e diámetro. 2. Nanopartícula según la reivindicación 1, en donde el tamaño medio de los poros de la nanopartícula es de entre 10 nm y 15 nm de diámetro, preferiblemente 12 nm de diámetro. 3. Composición que comprende una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1º2. 4. Método de producción de la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende: a. condensación de tetraetilortosilicato (TEOS) en un sistema bifásico consistente en una fase acuosa y una fase orgánica, donde la fase acuosa comprende una mezcla de cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) , trietanolamina y agua desionizada y la fase orgánica comprende en una mezcla de ciclohexano con TEOS donde la concentración de TEOS es de entre un 4% y un 6%, preferiblemente un 5%, b. extracción del surfactante CTAC y lavado, c. funcionalización de la superficie de la nanopartícula obtenida en (b) y sus poros con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) en tolueno, d. conversión de los grupos amino añadidos en la etapa (c) en ácidos carboxílicos mediante la adición de anhídrido succínico, y e. anclaje covalente de la Proteína G o la proteína A mediante química de conjugación con carbodiimidas. 5. Uso in vitro de una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o de una composición según la reivindicación 3, para la unión, extracción, aislamiento, purificación o concentración de inmunoglobulinas, o fragmentos funcionalmente equivalentes de las mismas, de una muestra. 6. Uso según la reivindicación 5, donde la inmunoglobulina es la inmunoglobulina G uando la nanopartícula comprende anclada una proteína G, o la inmunoglobulina A, D, E, M y/o G (exceptuando lgG3) cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína A. 7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, donde la muestra es una muestra biológica aislada de un sujeto o un medio de cultivo celular. 8. Uso según la reivindicación 7, donde la muestra biológica aislada de un sujeto es una muestra de sangre o suero. 9. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, donde el sujeto es un ser humano. 10. Método in vitro para el pretratamiento de una muestra biológica aislada de un sujeto para posteriormente diagnosticar una alergia que comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o con la composición según la reivindicación 3, en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, y (ii) eliminar las IgGs unidas a la nanopartícula. 11. Método in vitro para diagnosticar una alergia en un sujeto, que comprende las etapas (i) y (ii) del método según la reivindicación 10, y además: (iii) detectar los niveles de IgE en la muestra biológica obtenida tras la eliminación de la etapa (ii) , en donde unos niveles de IgE elevados respecto a un valor de referencia, es indicativo de que el sujeto sufre una alergia. 12. Método in vitro para el pretratamiento de una muestra biológica aislada de un sujeto para posteriormente diagnosticar una enfermedad autoinmune o una infección, que comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o con la composición según la reivindicación 3, en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente e las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, y (ii) purificar las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, unidas a la nanopartícula obtenida tras la etapa (i) . 13. Método in vitro para diagnosticar una enfermedad autoinmune o una infección en un sujeto, que comprende las etapas (i) y (ii) del método según la reivindicación 12, y además: (iii) cuantificar las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgGs, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, purificadas en la etapa (ii) , en donde unos niveles de inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, elevados respecto a un valor de referencia, es indicativo de que el sujeto sufre una enfermedad autoinmune o una infección. 14. Método in vitro para purificar o concentrar una inmunoglobulina, preferiblemente una IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de una inmunoglobulina, de una muestra, que comprende: (i) poner en contacto la muestra con una nanopartícula según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 o con la composición según la reivindicación 3, en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, y (ii) aislar las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, unidas a la nanopartícula obtenida tras la etapa (i) . 15. Método según la reivindicación 14, donde la muestra es una muestra biológica aislada o un medio de cultivo celular. 16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, donde la inmunoglobulina es la inmunoglobulina G cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína G, o la inmunoglobulina A, D, E, M y/o G (exceptuando lgG3) cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína A. 17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 donde la muestra biológica aislada es una muestra de sangre o suero. 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, donde el sujeto del que procede la muestra biológica es un ser humano.

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C01B 33/12 - A61K 9/51 - B82Y 5/00

Descripciones:
+ ES-2959709_A1 Nanopartículas mesoporosas de sílice v su uso en la captación de inmunoqlobulinas La presente invención se refiere a nanopartículas mesoporosas de sílice que comprenden acopladas en su superficie una proteína G o una proteína A y su empleo en la captación de inmunoglobulinas, siendo de utilidad en la purificación de éstas a partir de muestras y en el pretratamiento de muestras biológicas donde la purificación, concentración y/o eliminación de determinadas inmunoglobulinas es deseable como, por ejemplo, pero sin limitaciones, en el diagnóstico de alergias. Por lo tanto, la presente invención se enmarca dentro de la práctica clínica, preferiblemente, en el pretratamiento de muestras biológicas obtenidas de sujetos para facilitar el posterior diagnóstico de condiciones patológicas en las que hay una elevada expresión de inmunoglobulinas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La detección in vitro de inmunoglobulinas en suero constituye una estrategia ampliamente utilizada para el diagnóstico de una gran multitud de patologías, desde enfermedades infecciosas a enfermedades autoinmunes y alérgicas. El objetivo general de estas técnicas es la detección de algún tipo de anticuerpos específicos para un antígeno determinado, que puede estar presente en un agente infeccioso, en el propio organismo del paciente (autoantígeno) o provenir de otras fuentes exógenas (como los alérgenos) . La mayoría de las técnicas de diagnóstico in vitro de alergia se basan en la detección de la inmunoglobulina E (IgE) específica al alérgeno. Sin embargo, para ciertos tipos de alergia, la cantidad de IgE presente en suero es muy baja y puede quedar debajo de los límites de detección de las técnicas disponibles actualmente debido a su baja sensibilidad. Esto obliga a la utilización de métodos de diagnóstico in vivo (pruebas cutáneas y exposición controlada al alérgeno o provocación) , que no solo implican un mayor coste para el sistema sanitario, sino que suponen un riesgo para el paciente, sobre todo en casos de reacciones alérgicas graves en las que la exposición al alérgeno durante la prueba diagnóstica puede desencadenar una reacción anafiláctica. De ahí la gran utilidad del diagnóstico in vitro de alergia, específicamente los inmunoensayos. Estos consisten en una fase sólida a la que se conjuga una estructura alergénica que se incuba con el suero de los pacientes con sospecha de alergia. Posteriormente la utilización de un anticuerpo secundario anti-lgE de revelado (con mareaje radioactivo, fluorescente o de una enzima que participe en una reacción colorimétrica) permite identificar la presencia de IgE específica frente al alérgeno testado en el suero del paciente. En este contexto, hay varios factores que limitan la sensibilidad de estas pruebas diagnósticas, pero uno de los principales deriva de la elevada concentración de IgG en suero en comparación con la cantidad de IgE. La presencia de IgG específica al alérgeno ocupa parte de las estructuras alergénicas presentes en la fase sólida, lo que reduce o bloquea los sitios de reconocimiento disponibles para la unión de IgE específica, que es el analito que se desea detectar. No solo la unión de IgG específica al alérgeno limita la sensibilidad, sino que la propia presencia de cantidades elevadas de IgG, aunque esta no sea específica para el alérgeno, también limita la sensibilidad de los test de diagnóstico in vitro de alergia. Adicionalmente, la popularización de métodos de diagnóstico de alergia con multiplexado (detección simultánea de inmunoglobulinas frente a múltiples alérgenos) empeora esta situación, ya que se han descrito falsos positivos debido a la incorrecta detección de IgG específica al alérgeno (de desconocida utilidad clínica) como si fuese IgE específica al alérgeno (que es el biomarcador validado para el diagnóstico) . Por todo esto, se ha propuesto el uso de sistemas de pretratamiento de muestra basados en la retirada de IgG del suero previo a su análisis por los test de diagnóstico in vitro a alergia. Para llevar a cabo esta retirada, se han empleado sistemas comerciales de captación basados en partículas o columnas que tienen conjugada una proteína con capacidad de unión selectiva a la región constante de IgG humana (y sin capacidad de unión a IgE) , tales como la proteína A y la proteína G. Existen múltiples sistemas comerciales en los que se ha anclado una de estas dos proteínas (o una combinación de ambas) en la superficie de partículas o en la fase sólida de columnas, por lo que estos materiales pueden emplearse para la purificación o para la retirada de IgG de un fluido. Sin embargo, estos sistemas tienen diferentes limitaciones: requieren protocolos complejos y tiempos de incubación o volúmenes de muestra elevados y poseen una baja capacidad de captación de IgG (hasta 6-125 p, g IgG/mg material) , lo que obliga a realizar múltiples ciclos de tratamiento del suero para lograr el nivel de captación necesario. Estos requerimientos han evitado la traslación clínica de estas estrategias, y actualmente no existe ningún sistema comercial que se haya validado para su uso en muestras con fines diagnósticos. Todos los productos disponibles en el mercado consisten en una fase sólida (en forma de nano- o micro-partículas en polvo o en suspensión o bien dentro de una columna de afinidad) con proteína A, proteína G o una combinación de ambas conjugada en la superficie del material. A pesar de que existen productos fabricados con partículas de distintas composiciones y tamaños, no existen sistemas comerciales para la retirada de IgG basados en partículas mesoporosas con poros en el rango 2-50 nm. En este sentido, Hu etal. (J. Hu, etal., Microporous Mesoporous Mater, 2014, 197, 180-184) describieron la preparación de partículas magnéticas recubiertas de sílice mesoporosa a las que se ancló proteína G de forma covalente. El material de partida empleado poseía un tamaño de poro centrado en 3.27 nm, y a partir de éste se obtuvo también un material con poro expandido (con una distribución muy amplia de diámetros de poro, entre 5 y 100 nm) . Las partículas utilizadas en este estudio presentaban un diámetro en el rango de 50­ 100 nm, con una distribución de tamaños relativamente amplia (estimado por las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) mostradas en el trabajo) . En dicho estudio se observó una mayor capacidad de captación de IgG en el material de poro expandido, aunque la diferencia fue modesta (51 pg IgG/mg de material de poro expandido frente a 41 pg IgG/mg de material de poros de 3, 27 nm) . Adicionalmente, la capacidad de captación de IgG que mostraron (51 pg IgG/mg nanopartículas) aún es muy insuficiente para su uso en la práctica clínica. Además, la distribución del tamaño de poro en este material es muy amplia y las imágenes de TEM muestran muy poca homogeneidad en la porosidad de las partículas. Por otro lado, el área superficial de este material de poro expandido (43.4 m2/g) es muy pequeña comparado con otros materiales mesoporosos, lo cual puede limitar la cantidad de proteína anclada y, por tanto, la capacidad de captación de IgG. Estas dos limitaciones derivan del método empleado para producir los materiales, basado en obtener materiales con poros de menor tamaño, que son expandidos posteriormente, lo cual da lugar a una gran heterogeneidad en el tamaño final de los poros obtenidos y a una gran disminución del área superficial de material. Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de proporcionar materiales basados en la obtención de partículas mesoporosas a partir de los cuales se obtengan resultados mejorados en la captación de inmunoglobulinas, que además sean fiables y reproducibles y permitan la traslación a la práctica clínica. Dichos materiales deberían además presentar una distribución de tamaño de partícula y de tamaño de poro ltamente homogénea, que permita su reproducibilidad y maximice la eficiencia de la captación de inmunoglobulinas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores han observado que la captación de inmunoglobulinas por parte de un material mesoporoso con un tamaño de poro determinado acoplado a Proteína G (proteína G que carece de la región de reconocimiento de albúmina) o a Proteína A es mucho mayor que cuando se utiliza un material con un tamaño de poro fuera de los rangos de mesoporosidad aquí descritos. Partiendo de esta observación, los inventores diseñaron una nanopartícula que presenta una distribución de tamaño de partícula y de tamaño de poro altamente homogénea en comparación con otras nanopartículas mesoporosas del estado de la técnica, lo que permite la captación de inmunoglobulinas, particularmente de IgG, de manera más eficaz que otras metodologías ya existentes. La novedad de la presente invención reside en que al anclar proteína G' o la proteína A en nanopartículas mesoporosas del tamaño de poro aquí indicado (superior a 10 nm de diámetro, preferiblemente entre 10 nm y 15 nm de diámetro, más preferiblemente 12 nm de diámetro) , la capacidad de captación de inmunoglobulinas aumenta significativamente. En los ejemplos mostrados más adelante, se puede comprobar cómo otros tamaños de poro testados por los inventores para las nanopartículas mesoporosas de sílice, tales como 5.75 nm u 8.53 nm, dieron como resultado un porcentaje de proteína G' anclada a la nanopartícula menor (6.88% y 7.89% respectivamente) , frente al 8.94% obtenido con las nanopartículas de la invención (ver Tabla 2 de los Ejemplos mostrados más adelante) . Es importante destacar que, como consecuencia de lo comentado en el párrafo anterior, la capacidad de captación de IgG obtenida con las nanopartículas de la invención (450­ 800 pg de IgG por mg de nanopartículas) es sorprendentemente muy superior a la mostrada por otros sistemas comerciales o descritos en investigación (ver Tabla 3 de los Ejemplos) , suponiendo una mejora de al menos 4 veces con respecto al producto comercial de mejor rendimiento. Así, queda demostrado que, en comparación con los productos comerciales disponibles y con los otros tipos de nanopartículas mesoporosas de sílice con distintos tamaños de poro preparadas en los Ejemplos de la presente invención, las nanopartículas con mayor tamaño de poro (nanopartículas de la nvención) presentaron una capacidad de captación de IgG significativamente mayor a los otros sistemas, confirmando de forma definitiva que mediante el control del tamaño de poro de las nanopartículas a las que se ancla la proteína G se puede optimizar su capacidad de retirada de IgG. Este aumento en la eficacia de captación de inmunoglobulinas es de utilidad, por ejemplo, en el pretratamiento de muestras para el posterior diagnóstico de alergias donde la IgE está en concentraciones muy bajas en sangre/suero, por lo que la presencia de IgG en altas concentraciones puede enmascarar o dificultar la detección de la IgE, dando lugar a falsos negativos en el diagnóstico de un proceso alérgico. Por lo tanto, los inventores también proponen, en base a las nanopartículas de la invención aquí descritas, un método de pretratamiento de muestras y de diagnóstico de alergias que supera los inconvenientes de otras técnicas diagnósticas divulgadas en el estado la técnica. Otra ventaja derivada de la presente invención es que una vez retiradas las nanopartículas con la inmunoglobulina (lg) unida, se puede soltar dicha lg usando medios específicos para ello. Por lo que las nanopartículas de la invención se pueden usar, no solo en procedimientos de pretratamiento de muestras para concentrar inmunoglobulinas en aplicaciones de diagnóstico donde se detecte que una inmunoglobulina específica, por ejemplo la IgG, tenga niveles bajos (como alergias, otras enfermedades autoinmunes y enfermedades infecciosas) , sino también en aplicaciones tales como purificación de Igs de medios de cultivo. Tras eluir la inmunoglobulina unida a la nanopartícula de la invención, también se podría usar esta inmunoglobulina purificada para evaluar su papel en algunos tipos de reacciones alérgicas (ya que, por ejemplo, el papel de la IgE está bien establecido, pero en algunos tipos de alergia, el papel de la IgG aún está en duda) . Asimismo, también se propone un método para el pretratamiento de muestras y para el diagnóstico de infecciones y/o enfermedades autoinmunes en el que la purificación y/o concentración de las inmunoglobulinas implicadas en estas condiciones clínicas es relevante. En resumen, la presente invención, por tanto, demuestra que existe un tamaño de poro particular que permite un anclaje óptimo de la proteína G o la proteína A a las anopartículas mesoporosas en una conformación que permite optimizar su rendimiento de captación de inmunoglobulinas, preferiblemente IgG. Así, en un aspecto, la presente invención se relaciona con una nanopartícula mesoporosa de sílice que comprende una proteína G o una proteína A anclada de forma covalente, donde el tamaño medio de los poros de la nanopartícula es igual o superior a l O n m d e diámetro (de aquí en adelante, "nanopartícula de la invención") . En la presente invención, se entiende por "nanopartícula" aquella partícula que tiene dimensiones en la escala nanométrica, tales como dimensiones de entre 1.000 nm y 40 nm, entre 750 nm y 40 nm, entre 500 nm y 40 nm, entre 250 nm y 40 nm, entre 200 nm y 40 nm, entre 150nmy 40 nm, entre 100nmy 40 nm, entre 50 nm y 40 nm. La nanopartícula de la invención puede tener forma esférica, aunque no se descarta que pueda tener otras formas, tales como, aunque no de forma limitante, un elipsoide, una varilla, un cono, un cubo, un cuboide (por ejemplo, una caja rectangular) , una pirámide, y una forma irregular, etc. En determinados casos, se pueden incluir combinaciones de diferentes formas de nanopartículas. Como se ha indicado anteriormente, la nanopartícula puede tener una forma sustancialmente esférica y, por lo tanto, puede tener dimensiones medidas como un diámetro de la esfera, como un diámetro promedio de entre 1.000 nm y 40 nm, entre 750 nm y 40 nm, entre 500 nm y 40 nm, entre 250 nm y 40 nm, entre 200 nm y 40 nm, entre 150nmy 40 nm, entre 100 nm y 40 nm, entre 50 nm y 40 nm. El término "promedio" tal como se usa en el presente documento pretende ser la media aritmética. En algunas realizaciones particulares, una nanopartícula sustancialmente esférica tiene un diámetro promedio de 100 nm. En una realización más particular, la nanopartícula de la invención es esférica y más preferiblemente presenta un diámetro de entre 70y100 nm. En la presente invención se entiende por "nanopartícula mesoporosa de sílice" aquella nanopartícula que comprende dióxido de silicio (óxido de silicio (IV) ) . No obstante, otras nanopartículas mesoporosas que podrían también emplearse en la presente invención son nanopartículas mesoporosas de silicio o de carbono. La nanopartícula de la invención es una nanopartícula mesoporosa de sílice que tiene no o más poros expuestos en la superficie de la nanopartícula, de manera que la superficie accesible de la nanopartícula incluye la superficie exterior de la nanopartícula y las superficies interiores de uno o más poros dentro de la nanopartícula. En una realización particular, el material mesoporoso de sílice de la nanopartícula de la invención tiene una superficie específica desde 200 a 1.400 m2g-1, preferiblemente, desde 400 a 1.200 m2g-1, más preferiblemente desde 600 a 1.200 m2g-1. Métodos para determinar el tamaño del poro son ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Ejemplos de estos métodos incluyen, sin limitar a, experimentos de adsorción-desorción, porosimetría de mercurio, SAS (small-angle scatteríng) , NMR (nuclear magnetic resonance) y STM-AFM (scanning tunneling and atomic torce microscopies) entre otros. El tamaño promedio del poro generalmente se determina mediante el cálculo BET-BJH de datos de isoterma de desorción/adsorción de N2. Hasta la fecha, era desconocido en el estado de la técnica que existe un tamaño de poro concreto, dentro del rango mesoporoso, en el cual, al anclar la proteína G' o la proteína A, la capacidad de captación de inmunoglobulinas por parte de las nanopartículas es mucho mayor que con otros tamaños de poro (o con partículas no porosas) . Los inventores de la presente invención testaron nanopartículas con 5.75, 8.53 y 12.22 nm de diámetro de poro, y observaron que las de 5.75 y 8.53 nm de poro funcionaron igual entre ellas, pero las de en torno a 12 nm de poro funcionaron significativamente mejor. Por ello, en una realización particular de la nanopartícula de la invención, el tamaño medio de los poros de la nanopartícula es de entre 10 nm y 15 nm de diámetro, preferiblemente entre 11 y 14 nm, preferiblemente entre 11 y 13 nm, preferiblemente entre 11 y 12.5 nm, preferiblemente entre 11.5 y 12.5 nm, preferiblemente entre 12 y 12.5 nm, más preferiblemente el tamaño medio de los poros de la nanopartícula es 12 nm de diámetro. En una realización particular de la nanopartícula de la invención, los poros están distribuidos de forma homogénea a lo largo de la nanopartícula, es decir, al contrario que otras nanopartículas del estado de la técnica donde el núcleo es magnético y compacto (no poroso) y la parte de sílice mesoporosa está solo en la corteza externa, en las nanopartículas de la presente invención los poros ocupan todo el volumen de la nanopartícula, no sólo la corteza. La nanopartícula de la invención comprende anclada de forma covalente una proteína G o una proteína A. En la presente invención se entiende por "proteína G" la proteína G que carece de la/s región/es de reconocimiento de albúmina. En una realización particular, la proteína G comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 1. En otra realización más particular, la proteína G comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEQ ID NO: 1. Dentro de la presente invención también se engloban proteínas G recombinantes. SEQ ID NO: 1 En una realización aún más preferida, la Proteína G' empleada en la presente invención es la comercializada por Sigma Aldrich (Referencia 08062) . En la presente invención se entiende por "proteína A" una proteína encontrada originalmente en la pared bacteriana de Staphylococcus aureus y que tiene capacidad de reconocimiento de inmunoglobulinas, especialmente IgG. En una realización particular, la proteína A comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de, al menos, un 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con la secuencia SEQ ID NO: 2. En otra realización más particular, la proteína A comprende, o consiste en, una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia del 100% con la secuencia SEQ ID NO: 2. Dentro de la presente invención también se engloban proteínas A recombinantes. SEQ ID NO: 2 LNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYE ILHLPNLNEEQRNG La nanopartícula mesoporosa de sílice de la invención se encuentra anclada de forma covalente a la proteína G o a la proteína A. Los términos "unida" y "anclada" son quivalentes y pueden usarse indistintamente a lo largo de la presente descripción. En la presente invención se entiende por "anclada de forma covalente" el enlace químico en el cual los átomos implicados comparten electrones, es decir, no es una interacción electrostática, sino un enlace químicamente estable de manera que es improbable que la proteína se pierda de la superficie de la nanopartícula como consecuencia de interacciones inespecíficas con otras moléculas o por cambios en las condiciones del medio durante el procesamiento de la muestra en la que se encuentran. Un ejemplo de unión o anclaje covalente incluye, sin limitar a, un enlace tipo amida, al que se llega mediante química de conjugación con carbodiimidas. Otros tipos de reacciones que se podrían usar serían: reacción tiol-maleimida, reacción de cicloadición azida-alquino. Cualquiera de ellos puede usarse en el contexto de la presente invención. No obstante, en una realización particular de la nanopartícula de la invención, el anclaje covalente entre la nanopartícula y la proteína G o la proteína A se produce mediante química de conjugación con carbodiimidas. En la presente invención se entiende por "química de conjugación con carbodiimidas" a la activación de un ácido carboxílico empleando una carbodiimida, de forma que una amina primaria pueda posteriormente reaccionar con la forma activada del ácido dando lugar a la formación de un enlace amida estable en medio fisiológico. Como sabe el experto en la materia, tanto la superficie de la nanopartícula como la de los poros puede estar funcionalizada. En la presente invención se entiende que una superficie está "funcionalizada" cuando dicha superficie ha sido modificada químicamente con grupos funcionales. En función del tipo de reacción que se elija para anclar la proteína G o la proteína A, la superficie se funcionalizará con un grupo funcional u otro. Por ejemplo, en química de carbodiimidas, la reacción tiene lugar entre un ácido carboxílico y una amina, por lo que la nanopartícula debe funcionalizarse con uno u otro. Ya que se está uniendo una proteína (que también tiene tanto ácidos carboxílicos como aminas) , es preferible tener el ácido carboxílico en la nanopartícula y usar las aminas de la proteína para evitar reacciones secundarias indeseadas que tendrían lugar si se hiciese al revés. Si se selecciona otro tipo de reacción, la funcionalización debe ser como sigue, por ejemplo: para una reacción tiol-maleimida, la partícula debería funcionalizarse con grupos maleimida (y la proteína debería tener grupos tioles) , para unión por cicloadición azida-alquino, la partícula debería funcionalizarse con grupo azida o alquino (y la proteína debería modificarse con el otro, a que estos grupos no están presentes de forma nativa en las proteínas) . En una realización particular, la superficie de la nanopartícula y de los poros está funcionalizada con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) . La funcionalización con APTES se hace para disponer grupos amina en la superficie de las nanopartículas, lo cual es un paso intermedio para llegar a las nanopartículas funcionalizadas con ácidos carboxílicos. Este último grupo funcional, ácido carboxílico, es necesario para el anclaje de la proteína G' o la proteína A. Procedimientos para la obtención de la nanopartícula de la invención son ampliamente conocidos en la técnica anterior, por ejemplo, el descrito en Durfee, P.N. et al. 2016, ACS Nano 10: 8325-8345. Brevemente, el método de obtención de la nanopartícula de la invención comprende, preferiblemente, una primera etapa a) de síntesis de las nanopartículas mesoporosas de sílice mediante cualquier procedimiento conocido en el arte, una etapa b) de extracción del surfactante, una etapa c) de funcionalización de las nanopartículas, preferiblemente mediante aminación, más preferiblemente con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) en tolueno, una etapa d) de carboxilación de las nanopartículas, preferiblemente con anhídrido succínico en tetrahidrofurano (THF) , y una etapa e) de anclaje de la proteína G' o la proteína A mediante química de carbodiimidas. Así, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método de producción de la nanopartícula de la invención, donde dicho método comprende: a. condensación de tetraetilortosilicato (TEOS) en un sistema bifásico consistente en una fase de agua y una fase orgánica, donde la fase acuosa comprende una mezcla de cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) , trietanolamina y agua desionizada y la fase orgánica comprende en una mezcla de ciclohexano con TEOS donde la concentración de TEOS es de entre un 4% y un 6%, preferiblemente un 5%, más preferiblemente este paso (reacción de síntesis de la nanopartícula de partida) se lleva a cabo a 50ºC durante 24h, b. extracción del surfactante CTAC y lavado, preferiblemente donde la extracción del surfactante se lleva a cabo mediante intercambio iónico con una solución etanólica de nitrato amónico (10 mg/ml) a reflujo durante 1 hora, seguido de un segundo reflujo durante 2 horas en una disolución etanólica de HCI 12 mM, c. funcionalización de la superficie de la nanopartícula obtenida en (b) y sus poros con 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES) en tolueno, preferiblemente esta reacción se lleva a cabo en atmósfera inerte (utilizando nitrógeno) , a reflujo durante 24 horas, empleando 0, 5 pLAPTES/mg MSN (nanopartícula mesoporosa de sílice) , d. conversión de los grupos amino añadidos en la etapa (c) en ácidos carboxílicos mediante la adición de anhídrido succínico, esta reacción se lleva a cabo preferiblemente en presencia de tetrahidrofurano (THF) , bajo atmósfera inerte y a temperatura ambiente durante 24 horas, y e. anclaje covalente de la Proteína G o la proteína A mediante química de conjugación con carbodiimidas, preferiblemente se activan los ácidos carboxílicos en la superficie de las partículas dispersando las nanopartículas en tampón con ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES) con N-hidroxisuccinimida (NHS) e hidrocloruro de N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilcarbodiimida (EDC) , tras agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, las nanopartículas activadas se recogen, más preferiblemente por centrifugación, y se redispersan en tampón fosfato salino (PBS) con proteína G o proteína A en disolución, tras permanecer con agitación a temperatura ambiente durante 24 horas, las partículas con proteína G o proteína A anclada se lavan con PBS y se redispersan de nuevo en PBS. Otro aspecto se refiere a una nanopartícula mesoporosa de sílice que comprende una proteína G o una proteína A anclada de forma covalente, donde el tamaño medio de los poros de la nanopartícula es igual o superior a 10 nm de diámetro, preferiblemente entre 10 nm y 15 nm de diámetro, más preferiblemente 12 nm de diámetro, obtenida por el método anterior. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición que comprende la nanopartícula de la invención. Esta composición de la invención puede comprender además una matriz (macro) porosa en la que inmovilizar las nanopartículas de la invención, dicha matriz puede ser, por ejemplo, pero sin limitarnos, una columna de afinidad. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con el uso in vitro de la nanopartícula de la invención o de la composición de la invención para la unión, extracción (o eliminación) , aislamiento, purificación o concentración de inmunoglobulinas (preferiblemente de IgG) o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, de na muestra. En una realización preferida de este uso in vitro de la invención, la inmunoglobulina es la inmunoglobulina G cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína G, o la inmunoglobulina A, D, E, M y/o G (exceptuando lgG3) cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína A. Asimismo, el fragmento funcionalmente equivalente de una inmunoglobulina es el fragmento Fab, F (ab') 2 o Fe cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína G o A, o el fragmento scFv cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína A. En una realización particular, la unión, extracción, aislamiento, purificación o concentración de inmunoglobulinas se lleva a cabo mediante cromatografía de afinidad. En la presente invención se entiende por "muestra" una parte representativa de un todo. En una realización particular, la muestra es una muestra biológica aislada de un sujeto o un medio de cultivo celular. En la presente invención, el término "muestra biológica aislada de un sujeto" se refiere a cualquier material biológico fluido que se puede obtener del individuo, tal como sangre, suero, saliva, líquido cefalorraquídeo, líquido peritoneal, semen, esputo, lágrimas, moco, sudor, leche, extractos de cerebro y similares. En una realización particular, la muestra biológica aislada de un sujeto es sangre o suero. El término "aislado/a" implica que la muestra biológica ha sido separada o extraída del cuerpo humano o animal y opcionalmente también del resto de componentes que la acompañan de forma natural. Técnicas para obtener muestras, en particular, muestras biológicas de un sujeto, son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y cualquiera de ellas puede emplearse en la puesta en práctica de la presente invención. En la presente invención el término "sujeto" es equivalente al término "individuo", por lo que ambos términos pueden emplearse indistintamente a lo largo de la presente descripción. Se entiende por "sujeto" cualquier animal perteneciente a cualquier especie. No obstante, en una realización particular, el sujeto es un mamífero, preferiblemente, un primate, más preferiblemente, un ser humano de cualquier grupo étnico, sexo o edad. Como se ha comentado anteriormente, la ventaja de la nanopartícula de la invención es que su capacidad de carga de inmunoglobulinas es mucho mayor que la de otras anopartículas de composición similar pero con diferente tamaño de poro. El motivo de este efecto técnico es, como se ha dicho, la existencia de un tamaño de poro óptimo que permite, al anclar la proteína G o A, que la capacidad de captación de inmunoglobulinas sea mucho mayor. Por ello, la nanopartícula de la invención se propone para su uso en el aislamiento, purificación, concentración, eliminación o detección de inmunoglobulinas, tales como la IgG, o una parte funcionalmente equivalente de ellas, tal como fragmentos de unión a antígenos o Fab (de sus siglas en inglés Fragment antigen-binding) , F (ab) 2, o fragmentos variables de una sola cadena o scFv (del inglés single-chain variable fragment) . En la presente invención, se entiende por "inmunoglobulinas" cualquiera de los cinco isotipos correspondientes a IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. Se entiende por "IgG" uno de los cinco isotipos de anticuerpos humorales producidos por el organismo. Existen cuatro variantes o subclases de IgG designados con números: IgG 1 al IgG 4, y cualquiera de ellas puede detectarse/aislarse mediante el empleo de la nanopartícula de la invención, a excepción de la lgG3 cuando la proteína anclada a la nanopartícula es la proteína A. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para aislar, purificar o concentrar una inmunoglobulina, preferiblemente una IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de una inmunoglobulina, de una muestra, de aquí en adelante "método de aislamiento o purificación de la invención", que comprende: (i) poner en contacto la muestra con la nanopartícula de la invención o con la composición de la invención en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, y (ii) aislar las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, unidas a la nanopartícula obtenida tras la etapa (i) . La muestra a la que se refiere este método de la invención puede ser, pero sin limitarnos, una muestra biológica aislada o un medio de cultivo celular. En este método de la invención, la inmunoglobulina es la inmunoglobulina G cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína G, o la inmunoglobulina A, D, E, M y/o G (exceptuando lgG3) cuando la nanopartícula comprende anclada una proteína A. Las condiciones adecuadas para permitir la unión de las inmunoglobulinas presentes en la muestra a la nanopartícula de la invención son, preferiblemente, agitación a temperatura ambiente durante entre 30 a 120 minutos, más preferiblemente durante 60 minutos. En este sentido, por ejemplo, los inventores han demostrado una capacidad de eliminación de IgG superior al 90% en suero humano incubando 60 minutos (con agitación) a temperatura ambiente 50 microlitros de suero con 1 mg de las nanopartículas descritas en la presente invención. Los términos "IgG", "fragmento funcionalmente equivalente de ella", "muestra" y "sujeto" han sido definidos previamente en aspectos inventivos anteriores, así como sus realizaciones particulares, y son aplicables al presente aspecto inventivo. Así, en una realización particular del método de aislamiento de la invención, la muestra es una muestra biológica, más en particular, una muestra biológica aislada de un sujeto. En otra realización particular del método de aislamiento de la invención, el sujeto es un mamífero, preferiblemente, un primate, más preferiblemente, un ser humano de cualquier grupo étnico, sexo o edad. Preferiblemente, la muestra biológica aislada es una muestra de sangre o suero. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para el pretratamiento de una muestra biológica aislada de un sujeto para posteriormente diagnosticar una alergia, de aquí en adelante "primer método de pretratamiento de muestras de la invención", que comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la nanopartícula o con la composición de la invención, en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, y (ii) eliminar o extraer las IgGs unidas a la nanopartícula. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para diagnosticar una alergia, en un sujeto, de aquí en adelante "método de diagnóstico de alergia de la invención", que comprende las etapas (i) y (ii) del método descrito en el párrafo anterior y adicionalmente la etapa (iii) : (i) poner en contacto una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la nanopartícula o con la composición de la invención, en las condiciones adecuadas para permitir la nión de las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, (ii) eliminar o extraer las IgGs unidas a la nanopartícula, y (iii) detectar los niveles de IgE en la muestra biológica obtenida tras la eliminación de la etapa (ii) , en donde unos niveles de IgE elevados respecto a un valor de referencia, es indicativo de que el sujeto sufre una alergia. Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para el pretratamiento de una muestra biológica aislada de un sujeto para posteriormente diagnosticar una enfermedad autoinmune o una infección, de aquí en adelante "segundo método de pretratamiento de muestras de la invención", que comprende: (i) poner en contacto una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la nanopartícula o con la composición de la invención, en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, y (ii) purificar y/o concentrar las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, unidas a la nanopartícula obtenida tras la etapa (i) . Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar una enfermedad autoinmune o una infección en un sujeto, que comprende las etapas (i) y (ii) del método descrito en el párrafo anterior y adicionalmente la etapa (iii) : (i) poner en contacto una muestra biológica aislada de dicho sujeto con la nanopartícula o con la composición de la invención, en las condiciones adecuadas para permitir la unión de las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, presentes en la muestra a la nanopartícula, (ii) purificar las inmunoglobulinas, preferiblemente las IgG, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, unidas a la nanopartícula obtenida tras la etapa (i) , y (iii) cuantificar las inmunoglubulinas, preferiblemente las IgGs, o un fragmento funcionalmente equivalente de las mismas, purificadas en la etapa (ii) , en donde unos niveles de inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, elevados respecto a un valor de referencia, es indicativo de que el sujeto sufre una enfermedad autoinmune o una infección. Los términos "muestra biológica" y "sujeto" han sido definidos previamente. Dichas definiciones son aplicables a todos los métodos de la presente invención. Tal como se utiliza en la presente descripción, el término "diagnosticar" hace referencia a la identificación de la naturaleza de una dolencia, enfermedad u otro problema mediante examen de los síntomas, parámetros o biomarcadores en un sujeto. En el contexto de la presente invención, el parámetro requerido para el diagnóstico es la presencia de IgE, y la condición a diagnosticar es alergia; o la presencia de IgG y la condición a diagnosticar es una enfermedad autoinmune o infección. En la presente invención se entiende por "alergia" al conjunto de alteraciones de carácter respiratorio, nervioso o eruptivo que se producen en el sistema inmunológico por una extremada sensibilidad del organismo a ciertas sustancias a las que ha sido expuesto, y que en condiciones normales no causan esas alteraciones. Así, ejemplos de alergias incluyen, sin limitarse, alergia a fármacos, a alimentos, a hongos, al polen (gramíneas, coniferas, alérgenos del olivo, etc.) , al pelo de los animales (perros, gatos, etc., a los artrópodos (ácaros, etc.) , a compuestos químicos (insecticidas, productos de limpieza, fertilizantes, etc.) o al veneno de insectos tales como himenópteros (por ejemplo, abejas, abejorros o avispas) . La IgE es uno de los biomarcadores más importantes en el diagnóstico de las reacciones alérgicas, ya que es un anticuerpo producido por el sistema inmunitario en respuesta a algún factor o agente, interno o externo, que el organismo percibe como una amenaza, tal como un alérgeno o un parásito. La IgE es uno de los cinco tipos de inmunoglobulinas (A, G, M, D y E) . Normalmente, su concentración en sangre es muy baja, y su detección puede enmascararse debido a la presencia de IgG cuyos niveles son muy superiores. Así, en la primera etapa del método de diagnóstico de alergia de la invención, dicho método comprende eliminar o extraer la IgG en una muestra biológica aislada de dicho sujeto mediante el empleo de la nanopartícula de la invención. Una vez que la IgG ha sido eliminada de la muestra, se procede a la detección de la IgE. Técnicas para la detección de la IgE son ampliamente conocidas en el estado de la técnica y cualquiera de ellas puede emplearse en el método de diagnóstico de la invención. Una vez cuantificados los niveles de IgE, éstos se comparan con un valor de referencia si los niveles de IgE son mayores que los niveles de referencia, entonces se puede concluir que el sujeto sufre alergia. En la presente invención se entiende por "valor de referencia" aquellos niveles de IgE en una muestra biológica aislada de un sujeto que no padece alergia, o a la media de los niveles de IgE en un conjunto de sujetos que no padecen alergia. En la presente invención se entiende también por "valor de referencia" aquellos niveles de IgG, IgM, IgD o IgA, preferiblemente IgG, en una muestra biológica aislada de un sujeto que no padece infecciones o enfermedades autoinmunes, o aquellos valores derivados de la media de los niveles de dichas inmunoglobulinas en un conjunto de sujetos que no padecen dichas condiciones clínicas. En resumen, la presente invención se relaciona con una nanopartícula mesoporosa de sílice que comprende anclada una proteína G o una proteína A con un tamaño medio de diámetro poro como el aquí definido, con la composición que comprende dicha nanopartícula, con el uso de la misma para la captación, purificación, eliminación y/o aislamiento de inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, más preferiblemente para facilitar la determinación de IgE en el diagnóstico de alergias, así como con un método para purificar una inmunoglobulina, preferiblemente una IgG, y un método para diagnosticar infecciones o enfermedades autoinmunes en un sujeto. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Caracterización de S-MSN, M-MSN y L-MSN mediante dispersión de luz dinámica (panel superior) y microscopía electrónica de transmisión (panel inferior) . Figura 2. Caracterización de los materiales preparados tras cada etapa de modificación química mediante dispersión de luz dinámica (panel superior izquierdo) , potencial Z (panel inferior izquierdo) y espectroscopia infrarroja (panel derecho) . Figura 3. Estudios de captación de IgG por los materiales preparados. Captación de IgG en una disolución 1 mg/mL de IgG empleando diferentes cantidades de MSN-COOH y MSN-Proteína G (panel superior izquierdo) . Estudio de especificidad en la captación de IgG empleando mezclas IgG + IgE, evaluando captación de proteína total por Nanodrop y captación de IgE (marcada con FITC) por fluorimetría (panel superior derecho) . Captación de IgG en una disolución 1 mg/mL de IgG a distintos tiempos de incubación con L-MSN-Proteína G (panel inferior izquierdo) . Captación de IgG en una disolución 10 mg/mL de IgG empleando diferentes cantidades de L-MSN-Proteína G (panel inferior derecho) . Análisis estadístico realizado por ANOVA de dos vías para el panel superior izquierdo y mediante ANOVA de una vía para el panel inferior izquierdo, ambos empleando el Software Graphpad Prism 9. ns p>0, 05; ***p<0, 001; ****p<0, 0001. EJEMPLOS A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que ponen de manifiesto la efectividad de la nanopartícula de la invención en la captación de inmunoglobulinas. I. MATERIAL Y MÉTODOS Preparación de nanopartículas mesoporosas de sílice modificadas con proteína G. Las nanopartículas mesoporosas de sílice que servirán como base para el sistema de la invención se preparan por un método bifásico descrito previamente basado en la condensación de tetraetilortosilicato (TEOS) en un sistema bifásico agua/ciclohexano, usando trietanolamina como base y cloruro de cetiltrimetilamonio (CTAC) como surfactante agente director de la estructura (Durfee, P.N. et al. 2016, ACS Nano 10: 8325-8345) . La fase acuosa está compuesta por una mezcla de 24 mi de una disolución acuosa comercial de CTAC (25% p/v) ) , 0, 18 g de trietanolamina y 36 mi de agua desionizada. La fase orgánica consiste en 20 mi de una mezcla de ciclohexano con TEOS. La concentración de TEOS depende del material a preparar: 20 % para S-MSN (nanoportículas mesoporosas de sílice de tamaño de poro pequeño) , 10 % para M-MSN (nanoportículas mesoporosas de sílice de tamaño de poro mediano) y 5 % para L-MSN (nanoportículas mesoporosas de sílice de tamaño de poro grande) . La reacción de síntesis se lleva a cabo a 50 °C durante 24 horas. Posteriormente, el surfactante se extrae por intercambio iónico con una solución etanólica de nitrato amónico (10 mg/ml) a reflujo durante 1 hora, seguido de un segundo reflujo durante 2 horas en una disolución etanólica de HC112 mM. Finalmente, el material se lava con etanol 3 veces para obtener las nanopartículas de partida, ya sin surfactante. La superficie (tanto la externa de la partícula como la superficie expuesta de los poros) es funcionalizada entonces con 3aminopropiltrietoxisilano (APTES) en tolueno (Paris, J. L., et al. 2020. Acta Biomater 101: 459-468) . Esta reacción se lleva a cabo en atmósfera inerte (utilizando nitrógeno) , a reflujo durante 24 horas, empleando 0, 5 pL APTES/mg MSN (nanopartícula mesoporosa de sílice) . Tras lavar las nanopartículas con tolueno y etanol, se lleva a cabo la conversión de los grupos amino añadidos en ácidos carboxílicos (V. López, V., et al. 2017. ACS Appl. Mater. Interfaces 9: 26697-26706) . Para ello, se hace reaccionar el material aminado con anhídrido succínico (0, 2 mg por cada mg de MSN) en tetrahidrofurano (THF) , bajo atmósfera inerte y a temperatura ambiente durante 24 horas. Finalmente, y tras lavar el material con THF y etanol, se produce el anclaje de Proteína G mediante química de conjugación con carbodiimidas (Treerattrakoon, K., et al. 2017. Microchim. Acta 184: 1941-1950) . Para ello, se activaron los ácidos carboxílicos en la superficie de las partículas dispersando 5 mg de nanopartículas en 600 pL de tampón con ácido 2-morfolinoetanosulfónico (MES, 50 mM, pH 5, 5) con 1 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) y 1 mg de hidrocloruro de N- (3-dimetilaminopropil) -N-etilcarbodiimida (EDC) . Tras agitar a temperatura ambiente durante 1 hora, las nanopartículas activadas se recogieron por centrifugación y se redispersaron en 500 pL de tampón fosfato salino (PBS) con 1 mg de proteína G en disolución. Tras permanecer con agitación a temperatura ambiente durante 24 horas, las partículas con proteína G anclada fueron lavadas con PBS y redispersadas de nuevo en PBS a una concentración de10 mg/mL para experimentos posteriores. Caracterización de nanopartículas mesoporosas de sílice. Para confirmar la correcta preparación y modificación química de las nanopartículas, se realizó su caracterización mediante múltiples técnicas. Las medidas de dispersión de luz dinámica (DLS) y potencial Z se realizaron con un equipo Malvern Zetasizer Nano ZS90, comprobando tanto el tamaño de partículas como su carga en superficie. El instrumento empleado está equipado con un "láser rojo" (A = 300 nm) y las medidas de DLS se realizaron con un ángulo de detección de 90°, mientras que para las medidas de potencial Z se empleó la aproximación de Smoluchowski. Para la espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) se usó un equipo FT/IR Jasco 4100 equipado con un accesorio de reflectancia total atenuada (ATR) . Para comprobar la morfología y el distinto tamaño de poro de las nanopartículas, se realizó la caracterización de estas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) en un equipo Thermo Fisher Scientific Tecnai G220 Twin, utilizando rejillas de cobre de tamaño de malla 200 cubierta con una película Formvar-Carbon. Las medidas de adsorción de nitrógeno (en un equipo Micromeritics ASAP 2020) y de termogravimetría (en un equipo TGA/DSC 1 de MetTIer Toledo) fueron realizadas en los Servicios Centrales de Apoyo a la Investigación (SCAI) de la Universidad de Málaga (UMA) . Experimentos de retirada de IqG. Para evaluar la capacidad de retirada de IgG por parte de las nanopartículas preparadas, se añadieron diferentes cantidades de nanopartículas (100, 300 o 500 pg) con o sin proteína G anclada a 300 pL de una disolución 1 mg/ml de IgG humana en PBS. Después de incubar a temperatura ambiente con agitación durante 30 minutos, se centrifugaron las muestras y se cuantificó la cantidad de IgG aún en el sobrenadante mediante espectrofotometría en un equipo Nanodrop 2000c (Thermo Scientific) . Posteriormente, se llevó a cabo un experimento análogo manteniendo la cantidad de nanopartículas constante (500 pg de partículas para 300 pl de solución de IgG) pero evaluando el efecto del tiempo de incubación (15, 30, 45 y 60 minutos) en la retirada de IgG. Finalmente, para evaluar la especificidad de la captación del sistema, se evaluó la captación de inmunoglobulinas en una mezcla de IgG e IgE (que sería el analito de interés en diagnóstico de alergia) . Para poder analizar concentración de IgE en la disolución con ambas inmunoglobulinas, se llevó a cabo un mareaje fluorescente de la IgE empleando isotiocianato de fluoresceína (FITC) . El mareaje de la IgE fue realizado incubando 25 pg de IgE humana junto con 2 pg de FITC en 100 pL de tampón carbonato (pH=10, 2) . Tras agitación a temperatura ambiente durante una hora, se purificó la IgE marcada empleando un sistema Amicon (30kDa) . Utilizando esta IgE marcada e IgG sin marcar, se preparó la mezcla IgG + IgE-FITC en PBS (1 mg/ml IgG, 1 pg/ml IgE-FITC) . Tras incubar las nanopartículas con la disolución de IgG + IgE-FITC durante media hora a temperatura ambiente (500 pg de partículas para 300 pl de la mezcla IgG + IgE-FITC) , se centrifugaron las muestras y los sobrenadantes fueron analizados mediante espectrofotometría en Nanodrop para evaluar la concentración total de proteína no capturada por las nanopartículas. Posteriormente, se llevó a cabo una dilución 1:3 de dichos sobrenadantes con PBS para medir la concentración de IgE utilizando un fluorímetro. II. RESULTADOS Primero se prepararon las nanopartículas mesoporosas de sílice (MSNs) con tres tamaños de poro diferentes: pequeño (S-MSN) , mediano (M-MSN) y grande (L-MSN) . La correcta preparación de los tres materiales se confirmó mediante dispersión dinámica de luz (DLS) , microscopía electrónica de transmisión (TEM) y adsorción de nitrógeno. Los resultados de DLS mostraron la correcta preparación de partículas monodispersas con tamaños en el rango de 70-100 nm de diámetro para los tres tipos de partículas preparadas (Figura 1) . Mediante TEM se confirmó el tamaño de partícula observado por DLS, así como se observó la presencia de poros con el orden de tamaños deseado: poro S-MSN < poro M-MSN < poro L-MSN (Figura 1) . El tamaño de poro de cada tipo de partícula fue finalmente determinado por adsorción de nitrógeno (Tabla 1) , observando un tamaño de poro de 5.75 nm para S-MSN, 8.53 nm para M-MSN y 12.22 nm para L-MSN. En todos los casos, se han obtenido partículas con una gran área superficial (> 400 m2/g) . Tabla 1. Caracterización de los materiales S-MSN, M-MSN y L-MSN mediante adsorción de nitrógeno. Los materiales preparados fueron entonces modificados químicamente mediante varias etapas: aminación, carboxilación, anclaje de proteína G. El correcto desarrollo de cada etapa fue confirmado por varias técnicas de caracterización. Mediante DLS se confirmó que no se produjo ningún cambio drástico del tamaño de partícula en ninguna etapa del proceso, confirmando que las partículas no sufrieron agregación por ninguna de las modificaciones realizadas (Figura 2) . Mediante medidas de potencial Z (Figura 2) se observó el cambio de valores negativos en el material recién sintetizado a valores positivos tras la aminación (MSN-NH2) , con vuelta a valores negativos tras la carboxilación (MSN-COOH) , y valores finales también negativos para los materiales con proteína G anclada (MSN-Proteína G) . Mediante espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FTIR) , se observan las bandas características de la sílice en odos los materiales preparados (700-1300 cm-1) . Mediante FTIR (Figura 2) se confirmó también la presencia de grupos ácido carboxílico en las partículas carboxiladas (banda a 1720 cm'1) , así como de señales de grupos amida que confirman el anclaje covalente del anhídrido succínico empleado a los grupos amino de las partículas (bandas amida I y amida II a 1650 y 1560 cm'1 respectivamente) . Finalmente, la desaparición de la banda de ácido carboxílico y el aumento de la intensidad relativa de las señales de amida I y amida II confirma la unión de la proteína. La cantidad de proteína G anclada a cada material fue determinada por termogravimetría (Tabla 2) , mostrando un porcentaje en masa de 6.88 % para S-MSN, 7.89 % para M-MSN y 8.94 % para L-MSN. Estos datos confirman la parte inicial de nuestra hipótesis, al mostrar que la cantidad de proteína G anclada a las MSN depende del tamaño de poro de las nanopartículas. Tabla 2. Caracterización mediante termogravimetría de los materiales MSN-COOH y MSN-Proteína G para los tres tamaños de poro preparados. Una vez obtenidas las nanopartículas deseadas, evaluamos su capacidad de captación de IgG humana. Para ello, dispersamos diferentes cantidades de las MSN con proteína G anclada en una disolución de 1 mg/ml de IgG. El mismo experimento se realizó con MSN carboxiladas (sin proteína G) como control. Tras media hora de incubación a temperatura ambiente, las MSN fueron retiradas por centrifugación y se cuantificó la cantidad de IgG remanente en el sobrenadante. Los resultados obtenidos (Figura 3) muestran que las MSN sin proteína G tienen una captación inespecífica de IgG muy baja (inferior al 15%) , y que no parece dependiente de la concentración de partículas. Por otro lado, todas las MSN con proteína G mostraron capacidad de retirada de IgG humana, con un aumento de la cantidad de IgG captada al aumentar la concentración de partículas. De entre los tres materiales preparados, las partículas con mayor tamaño de poro (L-MSN) presentaron una capacidad de captación de IgG significativamente ayor a los otros dos materiales, confirmando de forma definitiva nuestra hipótesis de partida: mediante el control del tamaño de poro de MSN a las que se ancla proteína G se puede optimizar su capacidad de retirada de IgG. Es importante destacar que la capacidad de captación de IgG que hemos obtenido con este material (450-800 pg de IgG por mg de partículas) es muy superior a la mostrada por otros sistemas comerciales o descritos en investigación (ver Tabla 3 abajo) , suponiendo una mejora de al menos 4 veces con respecto al producto comercial de mejor rendimiento (Magne™ Protein G Beads (Promega) : Tabla 3. Datos de capacidad de captación de sistemas comerciales (la mayoría con partículas magnéticas) , según sus fabricantes. Adicionalmente, se evaluó la especificidad de la captación de IgG en mezclas IgG + IgE, observando que las nanopartículas preparadas son capaces de captar un elevado porcentaje de IgG mientras que la retirada de IgE (en mucha menor concentración) fue casi inexistente. Con respecto al tiempo de incubación óptimo, se encontró que tras 30 minutos un aumento del tiempo de incubación (a 45 o 60 minutos) no condujo a un aumento significativo de la cantidad de IgG captada. Finalmente, se evaluó el comportamiento del mejor material preparado (L-MSN con proteína G) en una disolución de IgG a concentración relevante clínicamente (10 mg/ml) , observando que con 1 mg de partículas se retira más del 90% de la cantidad de IgG en 50 pl de esta disolución tras una única incubación de media hora. Estas condiciones serían fácilmente trasladables al entorno clínico, mostrando el gran potencial de este material para el pretratamiento de suero humano para su posterior uso en diagnóstico in vitro de alergia. Además, el protocolo de preparación descrito anteriormente en este ejemplo conduce a MSN con alta reproducibilidad entre lotes, tanto en tamaño de partícula como en tamaño de poro, así como en las distintas etapas de funcionalización. Adicionalmente, la distribución del tamaño de partícula y de diámetro de poro son también altamente homogéneos, una característica importante en el desarrollo de técnicas in vitro para cuantificación de biomarcadores. Estas características conducen también a una buena reproducibilidad en la retirada de IgG, haciendo al material apto para su traslación al entorno clínico.

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