Patente nacional por "Método para la licuación de una muestra respiratoria y para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra"

Reivindicaciones:
+ ES-2876048_A11. Método para la licuación de una muestra respiratoria, caracterizado porque consiste en la adición de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno a dicha muestra. 2. Método, según la reivindicación 1 donde la solución acuosa tiene una concentración de peróxido de hidrógeno de entre 0, 01 My1M. 3. Método, según la reivindicación 2 donde la solución acuosa tiene una concentración de peróxido de hidrógeno de 0, 3 M. 4. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3, donde la cantidad de la solución acuosa de peróxido de hidrógeno añadida a dicha muestra es de entre 10y20 microlitros por gramo de muestra. 5. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 4, donde la muestra respiratoria es una muestra de esputo, una muestra de aspirado bronquial, de lavado broncoalveolar, de raspado nasofaríngeo o de cepillado bronquial. 6. Método para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria, caracterizado por comprender: a) una primera etapa para la licuación de la muestra respiratoria según el método definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5, b) una segunda etapa que comprende la detección del microorganismo patógeno en la muestra respiratoria licuada obtenida en la primera etapa. 7. Método, según reivindicación 6, donde los microorganismos patógenos son virus, bacterias u hongos. 8. Método, según reivindicación 7, donde los microorganismos patógenos son bacterias seleccionadas de la lista que comprende: Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, enterobacterias, Haemophilus influenzae o Legionella pneumophila 9. Método, según reivindicación 7, donde los microorganismos patógenos son virus seleccionadas de la lista que comprende coronavirus, virus influenza, rotavirus, citomegalovirus y virus sincitial respiratorio. 10. Método, según reivindicación 7, donde los microorganismos patógenos son hongos seleccionadas de la lista que comprende: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Candida spp, Aspergillus fumigatos, Turulopsis glabrata, Aspergillus spp., Seudoallescheria boyii, Cr y ptococcous neoformans, y Zigomicetos 11. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 9, donde la detección de microrganismo patógenos en la segunda etapa se lleva a cabo mediante un biosensor. 12. Kit para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria caracterizado por que comprende o consiste en una solución acuosa de peróxido de hidrógeno y un biosensor configurado para detectar el microorganismo patógeno en cuestión. 13. Kit, según reivindicación 12, donde la solución acuosa tiene una concentración en peróxido de hidrógeno de entre 0, 01 My1M. 14. Uso del kit descrito en cualquiera de las reivindicaciones 12 o 13 para la detección de infecciones respiratorias en una muestra respiratoria.

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Descripciones:
+ ES-2876048_A1 Método para la licuación de una muestra respiratoria v para la posterior detección de infecciones respiratorias en dicha muestra La presente invención se refiere a un método para la licuación de muestras respiratorias, tales como muestras de esputo. Este tipo de muestras se caracterizan por ser muy viscosas o semisólidas por lo que, para la detección de microorganismos patógenos en ellas, precisan de un tratamiento previo a fin de hacerlas más líquidas y homogéneas. El método de licuación propuesto en la presente invención permite la posterior detección de microorganismos patógenos causantes de infecciones respiratorias. Por tanto, la presente invención se encuadra en el campo de la medicina y, en particular, en lo referente a la detección de infecciones del tracto respiratorio. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las infecciones del tracto respiratorio son el origen de un elevado porcentaje de los casos de sepsis y son particularmente preocupantes en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y fibrosis quística. De entre estas, las infecciones nosocomiales, como, por ejemplo, las producidas por la bacteria Pseudomonas aeruginosa, deben detectarse lo más rápidamente posible ya que requieren un tratamiento antibiótico diferente al resto de patógenos debido a su multiresistencia a la mayoría de los mismos. Actualmente esto requiere cultivar el esputo del paciente, lo que puede tardar varios días. Por lo tanto, aunque el cultivo bacteriológico es el estándar de oro para la detección de bacterias, no es adecuado para guiar la primera tanda de antibiótico. En casos de sepsis o exacerbaciones de EPOC, la administración de una terapia antimicrobiana inadecuada puede dar lugar a graves secuelas o incluso a la defunción del paciente. Además, el hecho de requerir demasiado tiempo e infraestructura, no lo hace un procedimiento adecuado para la detección rápida en el punto de atención sanitaria. También se conocen métodos para la detección de patógenos en muestras de esputo que requieren la extracción de ácidos nucleicos, pero esto de nuevo requiere de un aborioso método adicional difícil de realizar fuera de un laboratorio especializado (Kukhtin A. V. et al. Anal. Chem. 2020, 92, 5311-5318) . En los últimos años una nueva generación de biosensores ha surgido como alternativa rápida a los métodos de cultivo microbiológico y de extracción de ácidos nucleicos para la detección de bacterias. En el contexto de la detección de bacterias en esputo, dichos dispositivos podrían reducir el tiempo necesario para identificar este patógeno, permitiendo así personalizar el tratamiento antibiótico. Sin embargo, la detección de bacterias y, en general, de cualquier microorganismo patógeno en muestras de esputo, o en otro tipo de muestra respiratoria, es problemática porque dichas muestras son muy viscosas o semisólidas y los patógenos no tienen por qué estar distribuidos homogéneamente en ellas. El principal componente de las muestras respiratorias son las mucinas, unas glicoproteínas que oligomerizan para dar lugar a un entramado entrecruzado en el que se encuentran atrapados los microorganismos patógenos. Además, en el caso de algunas bacterias, como es el caso de la Pseudomonas aeruginosa, suelen encontrarse en forma de biofilms (biopelículas) lo que complica todavía más su detección ya que, aunque la concentración total de bacterias en la muestra puede ser elevada, muchas pueden encontrarse ocultas dentro del biofilm y, por lo tanto, no dar señal. Por ello, para hacer posible la detección rápida de patógenos en muestras respiratorias, es necesario un método que licúe la muestra y al mismo tiempo disgregue biofilms bacterianos en caso de que éstos se formen, todo ello en unos pocos segundos y con un procedimiento sencillo que pueda realizarse en el punto de atención médica. A día de hoy se conocen algunos métodos para procesar muestras de esputo para la posterior detección de microorganismos patógenos con un biosensor que se detallan a continuación. Ha sido propuesta la utilización de compuestos tiolados como la N-acetilcisteína (He, F. & Zhang, L. Anal. Sci. 18, 397-401 (2002) ; Kim, J. H. et al. Lab Chip 12, 1437-1440 (2012) ) o un preparado de ditriotreitol comercial llamado Sputasol (Massai, F. et al. Biosens. Bioelectron. 26, 3444-3449 (2011) ) para licuar el esputo. Estos métodos requieren de tiempos de incubación de entre 10 minutos y 1 hora, y pueden requerir de instrumentación adicional como un agitador tipo vórtex para disgregar la muestra o un baño termostático, lo cual las hace más difíciles de mplementar en aplicaciones de campo. Además, estos compuestos se utilizan para disgregar el esputo, pero no son capaces de disgregar el biofilm bacteriano en el caso en el que dicho biofilm esté presente en la muestra. Otros métodos basados en la utilización de NaOH y surfactantes sufren de los mismos problemas (Inoue, S. et al. PLoS One 9, 1-7 (2014) ) . Finalmente se han propuesto otros métodos que se basan en la utilización de disolventes orgánicos como cloroformo (Buzid, A. et al. Sci. Rep. 6, 1-9 (2016) ) o diclorometano (Wen, K. Y. et al. ACS Synth. Biol. 6, 2293-2301 (2017) ) que son inflamables y sólo pueden manipularse dentro de una campana de extracción, haciéndolos de nuevo inadecuados para la detección de microorganismos patógenos en el punto de atención sanitaria. Entre los biosensores conocidos para la detección de microorganismos podemos citar, a modo de ejemplo, los divulgados en los siguientes documentos: Kumar N. et al. Analyst. 2018;143 (2) :359-373; Radhakrishnan R. et al. Biosensors. 2017;7 (4) :1-12; Cesewski E. et al. Biosensors and Bioelectronics. 2020, 159: 12214. A la vista de los inconvenientes existentes en los métodos actuales para procesar muestras respiratorias para la posterior detección de microorganismos patógenos en las mismas, la presente invención propone un método de procesamiento ultrarrápido, sencillo y económico, de manera que es posible la licuación y homogeneización de la muestra en pocos segundos. Esto permite, asimismo, llevar a cabo una detección de microorganismos patógenos en la muestra de forma rápida, precisa y eficaz, así como su aplicación en los puntos de atención sanitaria. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los inventores han descubierto que la adición exclusiva de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno (H2O2) sobre una muestra de esputo da lugar a la licuación y homogeneización de dicha muestra en un tiempo de un minuto aproximadamente. El peróxido de hidrógeno se descompone en oxígeno y agua en presencia de la enzima catalasa presente en las muestras respiratorias, así como en los posibles microorganismos patógenos existentes en ella, de manera que se generan burbujas. La generación de burbujas en el seno de la muestra es lo que favorece su disgregación hasta su total licuación y homogeneización. Luego, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método para la licuación de una muestra respiratoria, caracterizado porque consiste en la adición de una solución acuosa de peróxido de hidrógeno a dicha muestra. El método no precisa de ninguna instrumentación específica (agitador tipo vórtex, baño termostático, etc.) , ni de ningún otro reactivo o compuesto, ni de ninguna etapa adicional. Es decir, es suficiente con añadir la disolución acuosa de peróxido de hidrógeno a la muestra durante un tiempo aproximado de 1 minuto para obtener la muestra licuada y homogénea, lista para ser utilizada en la detección de cualquier microorganismo patógeno en ella. En la presente invención, "disolución acuosa de peróxido de hidrógeno" se refiere a una disolución que comprende agua (solvente) y peróxido de hidrógeno. De manera más preferida, se refiere a una disolución que consiste en agua y peróxido de hidrógeno. En otra realización preferida, se refiere a una disolución salina que comprenda peróxido de hidrógeno. De acuerdo con la presente invención "disolución salina" es una disolución acuosa que contiene al menos una sal disuelta. A modo de ejemplo, la disolución salina es la disolución tampón fosfato salino o buffer fosfato salino (conocido también por sus siglas en inglés, PBS, de phosphate buffered saline) . Esta solución PBS es una solución de tampón fosfato 10 mM, cloruro de sodio 0.14 M, cloruro potásico 0.003 M pH 7.4. En una realización preferida de la invención, la solución acuosa tiene una concentración de peróxido de hidrógeno de entre 0, 01 M y 1 M. Más preferiblemente, la concentración de peróxido de hidrógeno es de 0, 3 M En otra realización preferida, la cantidad de la solución acuosa de peróxido de hidrógeno añadida a dicha muestra es de entre 10 y 20 microlitros por gramo de muestra; más preferiblemente, de 20 microlitros por gramo de muestra. De acuerdo con la presente invención, el término "muestra respiratoria" se refiere a una muestra biológica aislada procedente del tracto respiratorio de un individuo. Esta muestra se origina en el tracto respiratorio superior, que comprende la cavidad nasal, os senos paranasales, la faringe y la laringe, o del tracto respiratorio inferior, que comprende la tráquea, los bronquios primarios y los pulmones. Se trata de muestras viscosas o semisólidas. De forma más preferida, las muestras respiratorias de la presente invención son las originadas en el tracto respiratorio inferior. En una realización preferida, la muestra respiratoria es una muestra de esputo, una muestra de aspirado bronquial, de lavado broncoalveolar, de raspado nasofaríngeo, de cepillado bronquial o cualquier otra secreción generada en el tracto respiratorio. El método de procesamiento descrito en este primer aspecto de la invención permite la licuación y homogeneización de la muestra respiratoria en cuestión de segundos, por lo que supone un método ultrarrápido para el pretratamiento de las mismas. Además, presenta la ventaja de ser económico y muy sencillo de llevar a cabo, por lo que resulta especialmente útil para aplicar en el punto de atención médica. La muestra resultante, ya licuada, puede utilizarse directamente para la detección de microorganismos patógenos en la misma, preferiblemente, mediante el uso de un biosensor. Otro aspecto de la invención se refiere a un método para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria, caracterizado por comprender: a) una primera etapa para la licuación de la muestra respiratoria según el método definido en el primer aspecto de la invención y b) una segunda etapa que comprende la detección del microorganismo patógeno en la muestra respiratoria licuada obtenida en la primera etapa. En la presente invención se entiende por "microorganismo patógeno" a un microorganismo, tal como un virus, una bacteria o un hongo, que causa enfermedad o infección respiratoria humana o animal. En una realización preferida, el microorganismo patógeno es un virus, una bacteria o un hongo que puedan infectar las vías respiratorias. En otra realización preferida, el microorganismo patógeno es una bacteria seleccionada de la lista que comprende: Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pneumoniae, enterobacterias, Haemophilus influenzae o Legionella pneumophila. En otra realización preferida, el microorganismo patógeno es un virus seleccionado de la lista que comprende: coronavirus, virus influenza, rotavirus, citomegalovirus y virus sincitial respiratorio. De manera más preferida, el coronavirus es seleccionado de: COVID-19, SARS-CoV-2, SARS y MERS y el virus influenza es seleccionado de: virus de la gripe común (humanos) y el virus de la gripe aviar. En otra realización preferida, el microorganismo patógeno es un hongo seleccionado de la lista que comprende: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitis, Coccidioides immitis, Sporothrix schenckii, Candida spp, Aspergillus fumigatos, Turulopsis glabrata, Aspergillus spp., Seudoallescheria boyii, Cr y ptococcous neoformans, y Zigomicetos (tales como Rhizopus sp., Mucor sp. y Absidia sp. etc) . La segunda etapa de detección de microorganismos patógenos se puede llevar a cabo mediante cualquier método conocido que detecte el propio patógeno o moléculas propias del mismo, como por ejemplo enzimas, carbohidratos, ácidos nucleicos, antígenos y metabolitos como moléculas de percepción de cuórum. Preferiblemente, la segunda etapa se lleva a cabo mediante un biosensor, y preferiblemente mediante un inmunosensor. El término "biosensor" se refiere a cualquier dispositivo de detección compuesto por un transductor y un elemento de reconocimiento, el cual consiste en una biomolécula, por ejemplo, un enzima, un aptámero, un ácido nucleico, un carbohidrato o un anticuerpo. En el caso de un inmunosensor, la biomolécula es un anticuerpo. Son conocidos en el estado de la técnica una amplia variedad de biosensores para detectar microorganismos patógenos que pueden ser usados en la presente invención en la etapa de detección, como el experto en la materia conoce. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit para la detección de infecciones respiratorias causadas por microorganismos patógenos en una muestra respiratoria caracterizado por comprender o consistir en una solución acuosa de peróxido de idrógeno y un biosensor configurado para detectar el microorganismo patógeno en cuestión. En una realización preferida del kit, la solución acuosa tiene una concentración en peróxido de hidrógeno de entre 0, 01 M .y 1M más preferiblemente de 0, 3 M. Un último aspecto de la invención se refiere al uso del kit descrito anteriormente para la detección de infecciones respiratorias en una muestra respiratoria. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Por el contrario, la palabra "consiste" es una expresión de tipo cerrado, que no puede interpretarse como que comprende productos o procedimientos que a su vez incluyen elementos estructurales o fases de procedimiento distintos de los expuestos en la reivindicación. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Fig. 1. Representación esquemática del método de licuación de una muestra respiratoria como es el esputo. A la muestra de esputo semisólida (i) se añade una solución de peróxido de hidrógeno (ii) de manera que la catalasa presente en la muestra genera burbujas de oxígeno (iii) que disgregan la muestra. Tras 1 minuto la muestra se ha licuado (iv) y puede aplicarse sobre un biosensor (v) para la detección de los patógenos. Fig. 2. Immunodetección de Pseudomonas aeruginosa después de la disgregación de un esputo de paciente que sufre una infección por Pseudomonas aeruginosa (círculo rojo) o no infectado (cuadrado negro) con el método propuesto. La señal colorimétrica S aumenta al aumentar la concentración de peróxido porque al generarse más burbujas se liberan más bacterias del esputo infectado con Pseudomonas aeruginosa. Las barras de error son la desviación estándar de 3 experimentos. Fig. 3. Muestra el incremento de luminosidad medido como el valor absoluto de la variación de la intensidad de pixel de una muestra de esputo de acuerdo con el ensayo realizado en el ejemplo 3 en el que se añade un inhibidor de la enzima catalasa. EJEMPLOS A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de los métodos de la invención. Ejemplo 1: Licuación de una muestra de esputo En primer lugar, se prepararon disoluciones de concentraciones 0, 01 M; 0, 03 M, 0, 1 M 0, 3 My 1M de peróxido de hidrógeno en PBS. Se añadieron 200 microlitros de cada disolución sobre 10 mg de esputo provenientes de un paciente con una infección respiratoria confirmada por Pseudomonas aeruginosa. Al adicionar la disolución, se observó la generación de burbujas. El tamaño y cantidad de burbujas aumentó con la concentración de peróxido en la disolución. Se comparó con la adición de agua o PBS (sin peróxido) que no produjo ninguna burbuja ni, por tanto, la licuación de la muestra de esputo. Cuando la concentración de peróxido es 0, 3 M la muestra se licúa en menos de 1 minuto. Las muestras licuadas y homogeneizadas obtenidas en este ejemplo se utilizaron directamente para la detección de P. aeruginosa en ellas, tal y como se explica en el ejemplo 2. Ejemplo 2: Detección de P. aeruginosa en las muestras de esputo licuadas obtenidas en el ejemplo 1 Las muestras de esputo que se licuaron previamente tal y como se ha indicado en el ejemplo 1 provenían de un paciente infectado con Pseudomonas aeruginosa y otro sin infectar. Pseudomonas aeruginosa se detectó en las muestras de esputo licuada con inmunosensores de papel utilizando nanopartículas de oro como sondas colorimétricas. El método de fabricación de biosensores de papel ha sido divulgado en varias publicaciones: Russell SM et al. ACS Sensors. 2017; 2:848-853; Russell SM et al. ACS Sensors. 2018;3 (9) :1712-1718; Alba-Patiño A. et al. Sensors Actuators, B Chem. 2018;273:951-954; Alba-Patiño A et al. ACS Sensors. 2020;5:147-153 y Alba-Patiño A. et al. Nanoscale Adv. 2020;2:253-1260. El método de fabricación del biosensor utilizado en este ejemplo particular ha sido previamente divulgado en detalle en la publicación Alba-Patiño A. et al. ACS Sensors. 2020, 5:147-153. Para detectar Pseudomonas aeruginosa, 10 pl de esputo (10 mg) licuado con 200 p, L de H2O2 a diferentes concentraciones entre 0 y 0, 3 M en PBS, se depositaron sobre la superficie receptora de una tira de papel de 2x8 cm y se dejaron secar a temperatura ambiente (entre 15 y 30 grados) durante 15 minutos. A continuación, se añadió 1 mL de PBS suplementado con albúmina de suero bovino (5 mg/mL) para evitar la formación de interacciones no específicas entre nanopartículas y el sustrato de papel. A continuación, se dobló el papel para que el reservorio con las nanopartículas decoradas con anticuerpo anti-Pseudomonas aeruginosa entre en contacto con la zona que contienen las bacterias, presionando ambas superficies con la ayuda de una pinza. Transcurridos 5 minutos, se eliminó el exceso de nanopartículas lavando la tira de papel con PBS suplementado con Tween-20 (0, 1%) y la señal colorimétrica S generada por las nanopartículas sobre la superficie receptora del inmunosensor, dependiente de la presencia de Pseudomonas aeruginosa en la muestra aplicada, se midió mediante densitometría. Para ello se escanearon los tests de papel con una impresora Brother MFC-1910 y se calculó la intensidad de píxel con la función Histograma del software Image J. La señal S se toma como el valor absoluto del número obtenido al restar 255 al valor de intensidad de píxel. El número 255 corresponde a la intensidad de píxel del color blanco puro. Los resultados obtenidos se muestran en la figura 2. Como se puede observar en dicha figura, la muestra con infección por Pseudomonas aeruginosa tratada sólo con PBS sin peróxido de hidrógeno (0 M) da lugar a una señal muy baja e indistinguible de la señal de la muestra sin infección por Pseudomonas aeruginosa. A medida que la concentración de peróxido de hidrógeno aumenta la señal de la muestra con infección por Pseudomonas aeruginosa aumenta porque se liberan más antígenos. La señal enerada por las muestras sin Pseudomonas aeruginosa no varía cuando la concentración de peróxido de hidrógeno aumenta, lo que demuestra que el aumento de señal observado en muestras que contienen Pseudomonas aeruginosa es producida por la bacteria y no por el tratamiento con peróxido de hidrógeno. La señal más alta se consiguió con muestras infectadas por Pseudomonas aeruginosa cuando el paso de licuación se llevó a cabo con peróxido de hidrógeno 0.3 M. Ejemplo 3: Tratamiento de una muestra de esputo con peróxido de hidrógeno y un inhibidor de catalasa Se pesaron 10 mgde esputo y se añadieron 100 microlitros de soluciones de PBS (tampón fosfato salino) con concentraciones crecientes de azida sódica (0, 0, 01, 0, 1 y 1 M) que es un inhibidor de la enzima catalasa. Se incubaron las muestras 2 horas a temperatura ambiente. Tras el pretratamiento se aspiró la azida con una micropipeta sin tocar los esputos. Seguidamente se añadieron 200 microlitros de PBS con 0, 3 M de peróxido de hidrógeno durante 1 minuto. Se tomaron fotos antes y después del tratamiento. En la muestra sin azida (0 M) , el esputo se disolvió totalmente y se registró el máximo incremento de luminosidad al calcular la intensidad de pixel con un software de tratamiento de imágenes como ImageJ o Adobe Photoshop seleccionando el área de interés y usando la función Histograma. A medida que fue aumentando la concentración de azida se fue reduciendo el número de burbujas producidas y el esputo se disolvió menos. Por lo tanto, el incremento de luminosidad fue disminuyendo. Los resultados obtenidos en este experimento han demostrado que la actividad catalasa presente en las muestras es crucial para la generación de burbujas y, por tanto, para disolver o licuar el esputo, ya que cuando se añade un inhibidor de esta enzima, no se consigue la disolución o licuación de la muestra.

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ES2876048 (11/11/2021) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
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En fecha 07/05/2020 se realizó Registro Instancia de Solicitud
En fecha 07/05/2020 se realizó Admisión a Trámite
En fecha 07/05/2020 se realizó 1001P_Comunicación Admisión a Trámite
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En fecha 11/11/2021 se realizó Publicación Solicitud
En fecha 11/11/2021 se realizó Publicación Folleto Solicitud con IET (A1)
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