Modelo de utilidad por "Nanopartículas de quitosano conteniendo encapsulado aceite esencial de ajo (Allium sativum L.)"

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+ ES-1304317_U1. Nanopartículas de quitosano que contienen encapsulado aceite esencial de ajo, caracterizadas porque el quitosano es un quitosano de bajo peso molecular, de 50-190 kDa, con un grado de desacetilación de 75-85% y la proporción quitosano: aceite esencial de ajo presente en las nanopartículas está en el rango de 1:0,25 a 1:0,75.

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+ ES-1304317_U Nanopartículas de quitosano conteniendo encapsulado aceite esencial de ajo (Allium sativum L.) La presente invención se refiere a nanopartículas de quitosano que contienen encapsulado aceite esencial de ajo, encontrando estas nanopartículas aplicación en el campo fitosanitario por su actividad antifúngica/antimicrobiana y elicitora para mejorar la defensa propia de las plantas frente al ataque por hongos o microbios. Más concretamente, en un primer aspecto, la invención proporciona nanopartículas de quitosano en las cuales el aceite esencial de ajo (Allium sativum L.) está encapsulado, teniendo las nanopartículas una distribución regular y forma esférica con un tamaño de partícula en el rango de 200-400 nm. Las nanopartículas de la invención presentan actividad antifúngica, especialmente frente a Aspergillus y Fusarium, y tienen efectos elicitores y de promoción del crecimiento de las plantas. Las enfermedades causadas por hongos patógenos del suelo son la causa de graves pérdidas en la producción agraria y una amenaza para la seguridad alimentaria. Los agentes antifúngicos han contribuido en gran medida a la protección de los cultivos agrícolas, lo que ha llevado a un aumento de la productividad agrícola. Sin embargo, el crecimiento de la población mundial, el calentamiento global y el aumento de la resistencia a los hongos implican nuevos desafíos para el sector agrícola. Recientemente la comisión europea (CE) ha anunciado la reducción del uso de pesticidas al 50% en el año 2030 a través de dos estrategias marco que convergerán paralelamente con el pacto verde, lo que lleva a la necesidad de utilización de nuevos pesticidas ecológicos y eficientes dentro de los cuales están los antifúngicos. En el informe de 20 de mayo de 2020 sobre la aplicación de la Directiva relativa al uso sostenible de los plaguicidas se puso de manifiesto que, si bien los Estados miembros han avanzado en la aplicación de dicha Directiva, menos de un tercio ha completado la revisión de sus planes de acción nacionales dentro del plazo legal de cinco años y, de los que sí los han revisado, la mayoría no ha subsanado las deficiencias detectadas por la Comisión en los planes de acción nacionales iniciales. En el marco del Pacto Verde Europeo y, en particular, de sus Estrategias «De la Granja a la Mesa» y sobre Biodiversidad, la Comisión adoptará medidas para reducir un 50 % ara 2030 el uso y el riesgo de los plaguicidas químicos, en particular el uso de los plaguicidas más peligrosos. A tal fin, la Comisión revisará la Directiva relativa al uso sostenible de los plaguicidas y promoverá un uso mayor de formas alternativas para proteger las cosechas frente a plagas y enfermedades. En la agricultura se utilizan diferentes tipos de agentes antifúngicos para el tratamiento previo y posterior a la cosecha, tales como carbamatos de metilbencimidazoles (MBC) , inhibidores de succinato deshidrogenasa (SDHI) , anilinopirimidinas (AP) , inhibidores de Qo (QoI) , morfolina y azoles (Brauer et al., 2019, Antifungal agents in agriculture: Friends and foes of public health. Biomolecules, 9 (10) , 1-21. https://doi.org/10.3390/biom9100521) . Actualmente, los triazoles son los antifúngicos más utilizados debido a su alta eficiencia y actividad de amplio espectro. Dentro de esta familia, el Tebuconazol (TB) es un eficaz fungicida sistémico que ha sido ampliamente utilizado tanto en el sector agrícola como en el médico para el control de enfermedades fúngicas y es el principal antifúngico utilizado en la actualidad como agente de recubrimiento de semillas en diferentes cereales (Marín et al., 2013, Potential effects of environmental conditions on the efficiency of the antifungal tebuconazole controlling Fusarium verticillioides and Fusarium proliferatum growth rate and fumonisin biosynthesis. International Journal of Food Microbiology, 165 (3) , 251-258) . Sin embargo, el uso extensivo del tebuconazol y otros triazoles en la agricultura ha generado preocupaciones sobre sus repercusiones ambientales, así como los riesgos derivados de sus efectos toxicológicos y la aparición de cepas de hongos patógenos resistentes a los antifúngicos (Brauer, 2019, supra) . Se ha demostrado que la TB induce toxicidad cardiovascular en ratas macho adultas y hepatotoxicidad en diferentes especies como el pez cebra y los murciélagos frugívoros. Además, la presencia de este triazol en los ecosistemas se ha relacionado con la alteración endocrina de ciertas especies de animales en varios informes (Ma F et al., 2020; Li S et al., 2019 Environ Pollut; Lopez-Antia A et al., 2020 Environ Pollut) . Además, se ha sugerido que el uso de triazoles en la agricultura mediará la aparición de cepas resistentes a los antifúngicos que conducen a enfermedades humanas. En este contexto, se ha informado que el uso extendido de TB como agentes de recubrimiento en la siembra de semillas implica riesgos directos para las aves de las tierras de cultivo en ciertos ecosistemas (Lopez-Antia A, Ortiz-Santaliestra ME, Mougeot F, Camarero PR, Mateo R. Birds feeding on ebuconazole treated seeds have reduced breeding output. Environ Pollut. 2021 Feb 15;271:116292. doi: 10.1016/j.envpol.2020.116292. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33388683.) . En estas circunstancias, sería interesante desarrollar estrategias alternativas al tratamiento de la TB, combinando compuestos ecológicos con actividad antifúngica, así como inductores que mejoren las defensas propias de las plantas frente al ataque de hongos. En este contexto, los aceites esenciales (EO) y los terpenos surgen como agentes antifúngicos, antimicrobianos y antioxidantes naturales (Dagostino et al., 2019, Essential oils and their natural active compounds presenting antifungal properties. Molecules, 24 (20) ; (Valdivieso-Ugarte et al., 2019, Antimicrobial, antioxidant, and immunomodulator y properties of essential oils: A systematic review. Nutrients, 11 (11) , 1-29; Mahizan et al., 2019, Terpene derivatives as a potential agent against antimicrobial resistance (AMR) pathogens. Molecules, 24 (14) , 1-21) . Entre estos compuestos, el aceite esencial de Allium sativum L. está compuesto principalmente por disulfuro de alilo, trisulfuro de alilo, disulfuro de alil (E) -1-propenil, trisulfuro de alil metil y tetrasulfuro de dialilo (Thuy et al., 2020, Investigation into SARS-CoV-2 Resistance of Compounds in Garlic Essential Oil. ACS Omega, 5 (14) , 8312-8320) , y mostró propiedades antibacteriana y antifúngica contra Staphylocccus aureus, Salmonella enteritidis, Listeria monocytogenes, Aspergillus niger, Penicillium cyclopium y Fusarium oxysporum entre otros (Benkeblia, 2004, Antimicrobial activity of essential oil extracts of various onions (Allium cepa) and garlic (Allium sativum) . LWT - Food Science and Technology, 37 (2) , 263-268; Somrani et al., 2020, Garlic, onion, and cinnamon essential oil anti-biofilms effect against Listeria monocytogenes. Foods, 9 (5) , 1-12) . A pesar de sus propiedades prometedoras, las aplicaciones de aceites esenciales y terpenos siguen obstaculizadas por su alta volatilidad, baja solubilidad en agua y su inestabilidad frente a la luz y el oxígeno (Niza et al., 2020, PEI-coated PLA nanoparticles to enhance the antimicrobial activity of carvacrol. Food Chemistr y , 328) . La encapsulación de estos compuestos bioactivos es un método eficaz para protegerlos contra la degradación en condiciones ambientales adversas. Además, la encapsulación puede usarse no solo para mejorar la vida útil de los aceites esenciales, sino también para controlar los sistemas de liberación (Vahedikia et al., 2019, Colloids and Surfaces B: Biointerfaces Biodegradable zein fi lm composites reinforced with chitosan nanoparticles and cinnamon essential o il: Physical, mechanical, structural and ntimicrobial attributes. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 177 (December 2018) , 25-32) , por lo tanto, manteniendo la bioactividad antimicrobiana de compuestos inestables, mejorando su solubilidad en agua y biodisponibilidad de compuestos lipofílicos (Hasheminejad et al., 2019, Improving the antifungal activity of clove essential oil encapsulated by chitosan nanoparticles. Food Chemistr y , 275 (August 2018) , 113­ 122) . Han sido probados distintos materiales de construcción como poli-l-lactida (Niza et al., 2020, supra) y diferentes tipos de nano-formulaciones como liposomas (Sebaaly et al., 2015, Preparation and characterization of clove essential oil-loaded liposomes. FOOD CHEMISTRY, 178, 52-62) , nano-emulsiones (Noori et al., 2018, Antimicrobial and antioxidant efficiency of nanoemulsion-based edible coating containing ginger (Zingiber officinale) essential oil and its effect on safety and quality attributes of chicken breast fillets. Food Control, 84, 312-320) y nanopartículas lipídicas sólidas entre otros, para vehiculizar terpenos y diversos aceites esenciales (Bazzaz et al., 2018, Solid lipid nanoparticles carr y ing Eugenia car y ophyllata essential o il: the novel nanoparticulate systems with broad-spectrum antimicrobial activity. Letters in Applied Microbiology, 66, 506-513) para mejorar sus propiedades antimicrobianas. Por otro lado, el quitosano es un copolímero lineal compuesto por unidades de D-glucosamina y N-acetil-D-glucosamina enlazadas en p- (1-4) y está atrayendo la atención como una materia prima prometedora en las industrias farmacéutica, médica y en la agricultura, en aplicaciones de control de las enfermedades de las plantas (Hosseinnejad & Mahdi, 2016, International Journal of Biological Macromolecules Evaluation of different factors affecting antimicrobial properties of chitosan. International Journal of Biological Macromolecules, 85, 467-475) . Se usa ampliamente en el control de cultivos y en la agricultura para controlar las enfermedades de las plantas, y se ha demostrado que presenta toxicidad contra un amplio espectro de hongos, inhibiendo tanto el crecimiento como el desarrollo (Muzzarelli et al., 2001, International Journal of Biological Macromolecules Evaluation of different factors affecting antimicrobial properties of chitosan. International Journal of Biological Macromolecules, 85, 467-475) . Además, los oligosacáridos derivados de quitosano se han descrito como inductores que conducen a una variedad de respuestas de defensa en plantas hospedadoras contra infecciones microbianas, incluida la acumulación de fitoalexinas, proteínas relacionadas con patógenos (PR) e inhibidores de proteinasas, síntesis de lignina y formación de callosa (Hadrami et al., 2010, Chitosan in Plant Protection. Marine Drugs, 8, 968-987) . Además, el quitosano se ha aplicado omo agente de tratamiento foliar (Bittelli et al., 2001, Reduction of transpiration through foliar application of chitosan. Agricultural and Forest Metereology, 107, 167-175) , como enmienda del suelo (Rabea et al., 2003, Chitosan as Antimicrobial Agent: Applications and Mode of Action. Biomacromolecules, 4 (6) , 1457-1465) y como agente de recubrimiento de semillas (Kananont et al., 2010, Scientia Horticulturae Chitosan specificity for the in vitro seed germination of two Dendrobium orchids (Asparagales: Orchidaceae) . Scientia Horticulturae, 124 (2) , 239-247) . Además, este polisacárido catiónico tiene enormes potenciales aplicaciones en nanotecnología, debido a su fácil y controlable extracción, biocompatibilidad, biodegradabilidad, no toxicidad, propiedades antimicrobianas, fácil modificación química y, también, su capacidad para formar geles, películas y nanopartículas sólidas (Keawchaoon y Yoksan, 2011, Colloids and Surfaces B : Biointerfaces Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrolloaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 84 (1) , 163-171; Hu y Luo, 2016, Polyphenol-chitosan conjugates: Synthesis, characterization, and applications. Carbohydrate Polymers, 151, 624-639) . Se han aplicado diferentes técnicas de encapsulación para proteger aceites esenciales y terpenos, entre éstas el método de gelificación iónica vía un material no tóxico y multivalente como Tripolifosfato, (TPP) (Hadidi et al., 2020, Chitosan nanoparticles loaded with clove essential oil: Characterization, antioxidant and antibacterial activities. Carbohydrate Polymers, 236 (Februar y ) , 116075) para encapsular aceite esencial de orégano, eugenol, carvacrol, aceite esencial de menta spicata, de clavo, de Satureja hortensis L., entre otros (Fakhreddin et al., 2013, Two-step method for encapsulation of oregano essential oil in chitosan nanoparticles: Preparation, characterization and in vitro release study. Carbohydrate Polymers, 95 (1) , 50-56; Woranuch & Yoksan, 2013, Eugenol-loaded chitosan nanoparticles: I. Thermal stability improvement of eugenol through encapsulation. Carbohydrate Polymers, 96 (2) , 578-585; Keawchaoon & Yoksan, 2011, supra) . Diversos métodos de formulaciones de quitosano para formar nanopartículas de CH (NPCH) mostraron actividades prometedoras al promover la germinación de semillas y el crecimiento de plántulas en trigo, tomate y otras especies de plantas (Li et al., 2019, supra; Chun & Chandrasekaran, 2019, Chitosan and chitosan nanoparticles induced expression of pathogenesis-related proteins genes enhances biotic stress tolerance in tomato. International Journal of Biological Macromolecules, 125, 948-954) . En la EP1332676B1, "Biological pesticide based on chitosan and entomopathogenic nematodes", se describe una formulación de plaguicida biológico frente a un nematodo entomopatógeno. Se utilizó quitosano con una viscosidad entre 150 y 450 cps y un grado de desacetilación entre 50-99%, en una concentración entre 0, 08 y 0, 18% y un ácido débil a una concentración de 1 a 10% (v/v) , ajustándose el pH de dicha formulación en un rango de 4-7. La CN103626598B, "Functional chitosan biological slow-release fertilizer and preparation method thereof", describe un fertilizante biológico de quitosano funcional de liberación lenta que comprende una capa de recubrimiento de quitosano biodegradable, alcohol polivinílico, butiraldehído, almidón, adipato de di-n-hexilo y agua destilada. De acuerdo con el primer aspecto, la invención proporciona nanopartículas de quitosano en las cuales está encapsulado aceite esencial de ajo (Allium sativum LJ, teniendo las nanopartículas una distribución regular y forma esférica con un tamaño de partícula en el rango de 200-400 nm, teniendo las nanopartículas una estabilidad mejorada, actividad antifúngica, especialmente frente a Aspergillus versicolor, A. niger y Fusarium oxysporum, y con efectos elicitores y de promoción del crecimiento de las plantas, constituyendo una alternativa ecológica al uso de tebuconazol. En una forma de realización, el quitosano referido es un quitosano de bajo peso molecular, de 50-190 kDa, con un grado de desacetilación de 75-85%. En otra forma de realización, la proporción quitosano:aceite esencial de ajo presente en las nanopartículas está en el rango de 1:0, 25 a 1:1. Preferentemente, dicha proporción está en el rango de 1:0, 25 a 1:0, 75. El procedimiento de producción de las nanopartículas de quitosano conteniendo aceite esencial de ajo encapsulado se puede llevar a cabo mediante encapsulación del aceite esencial de ajo en nanopartículas de quitosano de acuerdo con las siguientes etapas: i) Obtención de una emulsión aceite-en-agua a partir de una disolución de quitosano al 0, 2% en ácido acético al 1%, con agitación, y sonicación hasta disolución completa, adición de aceite esencial de ajo junto con un emulsificante, tal como un polisorbato, y emulsificación a 1.000 durante 10 minutos; ii) Adición gota a gota de una solución de tripolifosfato de sodio al 0, 2%, a una velocidad de 2 ml/min, bajo agitación continua para inducir la gelificación iónica. De acuerdo con el segundo aspecto de la invención, ésta se refiere al uso de las nanopartículas antes descritas como principio activo antifúngico en las plantas y/o como elicitor para mejorar la resistencia de las plantas frente al ataque fúngico. En este contexto, las enfermedades de los cereales de importancia económica incluyen Blumeria graminis, Puccina recóndita, Puccinia graminis, Puccina Striiformis, Septoria tritici y Septoria nodorum, así como Fusarium. Así, el tizón de la espiga del trigo es la enfermedad más importante que afecta a este cultivo. Los hongos del género Fusarium, además del tizón de la espiga, también pueden causar otras enfermedades: marchitez de las plántulas, pudrición de la raíz o pietín del trigo. Además de las diferentes enfermedades de los cereales provocadas por los hongos mencionados, existen otros hongos que provocan pérdidas de grano durante el almacenamiento y después de la cosecha. Un estudio reciente mostró que los granos de cereales estaban infestados en diversos grados con hongos de almacenamiento. Se aislaron un total de 21 hongos diferentes, a saber, Alternaría alternata, Penicillium sp, Aspergillus niger, A. flavus, Curvularia lunata, Rhizopus stolonifer, Fusarium oxysporum y Mucus. Aspergillus fue el hongo aislado con mayor frecuencia seguido de Aspergillus niger A. flavus. Aspergillus fumigatus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus ochraceus, que fueron igualmente frecuentes en los granos (Varsha bhalerao & Ashok chavan, 2008, Isolation of filamentous fungi in post-harvest cereal grain during the storage and their effect in seed health. International Journal of Advanced Research, 5 (8) , 2171­ 2177) . El método más utilizado contra los patógenos de los cereales es la protección mediante el uso de fungicidas. Sin embargo, se ha observado que los patógenos están desarrollando resistencia a los diferentes fungicidas utilizados para proteger las plantas. El uso de productos químicos fitosanitarios también está asociado con la contaminación ambiental, ya que deja residuos de sustancias activas en el suelo y los granos. Las actividades fungicidas y fungistáticas de los aceites esenciales, junto con el conocimiento sobre sus usos tradicionales y nuevos y la creciente literatura sobre sus mecanismos de acción, los convierten en una alternativa atractiva para los fungicidas sintéticos. El éxito del uso de aceite esencial como fungicida se debe probablemente a que muchos compuestos actúan sinérgicamente, haciéndolos más eficaces contra los hongos patógenos de las plantas. Tal como se muestra en los ejemplos, las nanopartículas de quitosano conteniendo aceite esencial de ajo encapsulado en su interior aumentan la capacidad fungicida del ceite esencial de ajo. Dicha actividad es similar a la del Tebuconazol, con la ventaja de que las nanopartículas de la invención no son dañinas y, debido a su origen natural, tendrán mejor aceptación entre los consumidores que los agentes sintéticos. Además, los aceites esenciales y los extractos de plantas en general se degradan más rápidamente que la mayoría de los fungicidas químicos, son ecológicos y tienen menos probabilidades de matar hongos beneficiosos que los fungicidas sintéticos, con una mayor retención ambiental. En una forma de realización, la utilización de las nanopartículas de quitosano conteniendo aceite esencial de ajo encapsulado en su interior de la invención, se lleva a cabo por revestimiento de las semillas a tratar con una solución de las nanopartículas de la invención a una concentración de 2, 0-2, 5 g/l, por ejemplo, pulverizando semillas. En la figura 1 se muestran los datos de espectroscopía FT-IR de GEO (aceite esencial de ajo) , NPCH (nanopartículas de quitosano) y GEO-NPCH (nanopartículas de quitosano con aceite esencial de ajo encapsulado) de determinación de la estructura química de las nanopartículas de la invención. En la figura 2 se muestran los análisis termogravimétricos/calorimetría diferencial de barrido (TGADSC) del aceite esencial de ajo (GEO) . La Figura 3 muestra los análisis termogravimétricos (TGA) de NPCH y GEO-NPCH. La Figura 4 muestra los análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) de NPCH y GEO-NPCH. La Figura 5 muestra el diagrama de difracción de Rayos X (XRD) de polvo de quitosano, NPCH y GEO-NPCH. La Figura 6 muestra datos referidos a características de plantas tratadas con diferentes tratamientos a diferentes dosis: A) peso total, B) longitud de la raíz, C) longitud de las hojas y D) longitud del tallo. Ejemplos 1. Materiales y Métodos En los ejemplos y ensayos siguientes, se utilizó un quitosano (CH) de bajo peso molecular (50-190 kDa) con un 75-85% de desacetilación, tripolifosfato (TPP) , 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2-bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT) , tebuconazol (TB) y todos los isolventes fueron suministrados por Sigma-Aldrich (España) . Orius 20 EW (20% de tebuconazol) de Nufarm España y el aceite esencial de ajo (GEO) se compró a Pranarom. Los organismos utilizados para el ensayo antifúngico fueron especies de Aspergillus versicolor, A. niger y Fusarium oxysporum que se aislaron del suelo y se examinaron visual y microscópicamente para determinar las características morfológicas de los aislamientos como se describe en Palmero et al. (2014, Pathogenicity and genetic diversity of Fusarium oxysporum isolates from corms of Crocus sativus. Industrial Crops & Products, 61, 186-192) y se confirmaron mediante técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el uso de cebadores ITS tal como se describe en Gardes et al. (1993, ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes - application to the identification of mycorrhizae and rusts. Molecular Ecology, 113-118) . 2. Preparación de nanopartículas de quitosano con y sin aceite esencial de ajo encapsulado La encapsulación de GEO en nanopartículas de quitosano (GEO-NPCH) se formuló en un proceso de dos pasos: primero, emulsificación primaria de aceite en agua (o/w) , seguida del método de gelificación iónica descrito por Keawchaoon & Yoksan (2011, Colloids and Surfaces B : Biointerfaces Preparation, characterization and in vitro release study of carvacrol-loaded chitosan nanoparticles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 84 (1) , 163-171) con algunas modificaciones. Brevemente, se preparó una solución de CH al 0, 2% disolviendo CH en ácido acético al 1% con agitación continua durante la noche. Luego, la solución de CH se sonicó durante 10 minutos hasta que se disolvió por completo. Se mezclaron 50 ml de solución de CH a 1.000 RPM en una solución de Tween 80 al 1%, posteriormente se emulsionaron diferentes proporciones de CH:GEO (1:0, 1:0, 25, 1:0, 5, 1:0, 75 y 1:1) a 1.000 RPM durante 10 min. Finalmente, se añadió gota a gota una solución de TPP al 0, 2% a 2 ml/min con agitación continua para inducir la gelificación iónica. La agitación se llevó a cabo de forma continua a 700 RPM durante 40 min. Las nanopartículas se recolectaron después de centrifugar a 15.000 RPM durante 20 min a 4 °C y posteriormente se lavaron varias veces con agua mQ. La suspensión de nanopartículas se congeló a -80 °C y se liofilizó durante 48 ha -50 °C (LyoQuest-85 / 208V 60 Hz, Teslar) . 3. Determinación de la eficiencia de encapsulación y eficiencia de carga de nanopartículas de aceite esencial de ajo-quitosano (GEO-NPCH) Se mezcló una suspensión de muestra (100 ^l) con 5 ml de HCl 2M y se hirvió a 95 °C a reflujo. Después de enfriar, se añadió 1 ml de etanol absoluto a la mezcla homogénea antes de centrifugar a 9.000 rpm durante 1 min a 25 °C. El sobrenadante se analizó mediante espectrofotometría UV-vis en un rango de longitud de onda de 250-400 nm, cubriendo la longitud de onda de absorción máxima del aceite esencial de ajo (325 nm) . También se prepararon nanopartículas de quitosano sin GEO (NPCH) como control de la misma manera. La capacidad de carga (LC) y la eficiencia de encapsulación (EE) de GEO se calcularon de acuerdo con las siguientes ecuaciones: 4. Caracterización instrumental de las nanopartículas La caracterización de partículas de nano-formulaciones (tamaño, potencial zeta e índice de polidispersidad (PDI) ) se determinó mediante dispersión dinámica de luz (DLS) utilizando un Zetasizer (3000HSM Malvern Ltd, IESMAT, España) . Especificaciones: Índice de refracción (IR) de quitosano de 1.700, índice de absorción de 0, 010 y solvente de agua RI: 1, 33, con una viscosidad de 0, 8872 cP, el número de mediciones se realizó 3 veces. Los espectros de IR se registraron en un espectrofotómetro FT-IR equipado con un accesorio ATR y los picos principales se expresaron en cm-1. Los mecanismos de descomposición térmica se determinaron en un analizador termogravimétrico (TGA Q20, TA Instruments) equipado con una bandeja de platino estándar. Los experimentos de calorimetría diferencial de barrido (DSC) se llevaron a cabo utilizando un sistema DSC Q50 (TA Instruments) equipado con una bandeja de aluminio estándar. Se utilizó como referencia una muestra de indio. En todos los casos, se calentaron muestras de aproximadamente 3 mg a una velocidad de 10 °C min-1 en atmósfera de nitrógeno. Los patrones de difracción de rayos X (XDR) de las muestras se escanearon en un rango 20 de 5 a 60° utilizando un difractómetro X-R con un ángulo de velocidad de 0, 05°/min. Se realizó un análisis de calorimetría diferencial de barrido (DSC) para averiguar la estabilidad térmica de GEO, NPCH y GEO-NPCH puros utilizando un DSC (MODELO PATATIN) con una tasa de calor creciente de 10 °C/min (30-320 °C) . La superficie morfológica y el análisis de la forma de NPCH y GEO-NPCH se estudiaron mediante icroscopía electrónica de barrido, SEM. Las muestras se pulverizaron con Pt y se observaron con un microscopio electrónico Jeol 7800 F a 20 KV. 5. Determinación de la actividad antifúngica Se evaluaron diferentes proporciones de CH:GEO (1:0, 1:0, 25, 1:0, 5 y 1:0, 75) . Para el análisis antifúngico, se eligió la relación GEO-NPCH 1:0, 75 para realizar el ensayo, ya que esta combinación dio como resultado un PDI < 0, 7 y una LC superior a las relaciones 1:0, 5 y 1:0, 25. El ensayo antifúngico con esporas de A. versicolor, A. niger y F. oxysporum se realizó según Rubio-Moraga et al. (2014, Pathogenicity and genetic diversity of Fusarium oxysporum isolates from corms of Crocus sativus. Industrial Crops & Products, 61, 186-192) con algunas modificaciones. Los tratamientos se prepararon en un tubo Eppendorf estéril que contenía 3.000 esporas (40 ^l) de cada hongo en PDB estéril y 20 ^l de los diferentes tratamientos. La mezcla se añadió a un orificio perforado utilizando una pipeta Pasteur en el centro de las placas de agar PDA. Todas las placas se incubaron a 28 °C durante 6 días para evaluar el índice antifúngico (%) = ( (CT) /C) x 100, y las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) de cada tratamiento, donde C y T son crecimiento radial (mm) de placas control y tratadas de los diferentes hongos. Para el ensayo antifúngico después de la germinación de las esporas, una suspensión de esporas a una concentración de 5 x 103 esporas/ml (100 ^l) se transfirió a una placa de microtitulación de 96 pocillos. Las placas se incubaron 24 h a 28 °C y los tratamientos se agregaron mediante el método de dilución seriada con un factor de dilución 1/3. Las placas se incubaron durante otras 24 horas a temperatura ambiente y todas las placas se trataron con 10 ^l de bromuro de 3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5, -difeniltetrazolio (MTT; 5 mg/ml en PBS; Sigma) . Las placas se incubaron durante la noche a temperatura ambiente, seguido de la adición de 100 ^l de disolvente MTT (0, 1 NHCl en alcohol isopropílico anhidro) . 6. Evaluación de las nanopartículas de GEO-quitosano como agente de recubrimiento de semillas Para evaluar la tasa de germinación de los diferentes recubrimientos de semillas, se recubrieron tres lotes de 30 gramos de semilla de trigo (Triticum vulgare) , avena (Avena sativa) y cebada (Hordeum vulgare) con 3, 5 ml de cada tratamiento. Se utilizaron 30 gramos de semillas sin tratamiento, 30 gramos de semillas tratadas con NPCH y GEO-NPCH a 2, 5 mg/ml y 30 gramos de semillas tratadas con tebuconazol a dosis comerciales (9 mg/ml de Tebuconazol puro) . Después del recubrimiento, las semillas se ecaron a temperatura ambiente. Se colocaron lotes de 100 semillas de cada cereal en papel de filtro húmedo y se incubaron a 25 °C durante 5-7 días en una cámara de germinación a 21, 8 °C, con 8 horas de luz y 16 horas de oscuridad. El efecto sobre la germinación de las semillas se evaluó contando el número de semillas supervivientes. El experimento se realizó por triplicado. Para evaluar los efectos morfológicos en las plantas, se trataron lotes de 100 gramos de semillas de trigo con material NPCH y GEO-NPCH a diferentes concentraciones (7 mg/ml, 2 mg/ml y 1 mg/ml) . El efecto se comparó con la concentración recomendada por el fabricante TB (45 mg/ml de producto con 9 mg/ml de TB puro) . Cada tratamiento se probó en condiciones de campo. Las semillas se cultivaron, se dividieron 10 m2 del área de cultivo en 6 microparcelas para cada tratamiento. Se recogió un lote de 10 semillas para cada tratamiento 15 días después de la siembra. Las semillas se evaluaron midiendo el peso, la longitud de la raíz y la longitud de la hoja en mm. Se analizaron de tres a cinco réplicas biológicas con tres réplicas técnicas por réplicas biológicas. Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente por el método de Tukey utilizando el software estadístico GraphPad Prism versión 5.0.0 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, EE.UU. Las diferencias se probaron a < 0, 05 (nivel de probabilidad del 95%) . 7. Tamaño y carga superficial de las nanopartículas de GEO-quitosano Para mejorar la estabilidad y la eficiencia de encapsulación de GEO, se obtuvieron nanopartículas de GEO-quitosano como se describe en Materiales y métodos, utilizando diferentes formulaciones de relaciones CH:GEO desde 1:0 a 1:1. Para determinar el tamaño NP, el potencial Z y el índice de polidispersidad (PDI) de cada fórmula de relación, se aplicó la técnica DLS. Los resultados, que se muestran en la Tabla 1, indicaron que los NP varían de 172 a 352 nm de diámetro, el tamaño de estos NP crecía a medida que se incrementaba la cantidad de GEO, comportamiento que ha sido descrito previamente en otros aceites esenciales. El PDI mostró el mismo patrón en comparación con el patrón de tamaño de los NP, el índice de PDI de los NP aumentaba a medida que se incrementaba la cantidad de GEO, pasando de 0, 4 en 1:0, 25 a 0, 7 en 1:1, confirmando que las formulaciones, salvo la relación 1:1, son monodispersas y estables. A su vez, la formulación de relación CH:GEO 1:1 mostró un valor PDI > 0, 7, lo que demuestra una distribución de tamaño de partícula muy amplia. Todas las formulaciones ensayadas presentaron una carga superficial positiva con un intervalo de +19, 8 a +49, 8 mV, lo cual está de acuerdo con estudios previos sobre NP de quitosano que encapsulan diferentes moléculas activas. Estas cargas positivas surgen de la rotonación de grupos amino. La carga superficial positiva disminuye con el aumento de la cantidad encapsulada de GEO en NP debido a la interacción de GEO con NP, produciendo cambios en la estructura y carga. Además, los resultados del potencial Z confirman que NPCH y GEO-NPCH 1:0, 25, 1:0, 5 y 1:0, 75 tienen una alta estabilidad, como se muestra en la tabla 1, mientras que la relación 1:1 CH:GEO presenta una formulación más inestable (+ 19, 8 mV) , que coincide con el valor de PDI. Tabla 1 La composición química se determinó mediante la técnica FT-IR, los espectros FT-IR de GEO, NPCH y GEO-NPCH se muestran en la Figura 1. Los espectros de NPCH y GEO-NPCH son muy similares, ya que su contenido es principalmente quitosano. Se observa claramente una banda ancha entre 3750 cm-1 y 2500 cm-1, asociada al estiramiento de los enlaces O-H y N-H. Como se muestra a continuación en el análisis termogravimétrico, las nanopartículas de quitosano son higroscópicas y tienen una gran tendencia a absorber agua. Esta señal incluye tanto la estructura del quitosano O-H como el agua en sus diferentes fuerzas debido a los enlaces de hidrógeno formados. A partir de los espectros, se observan picos característicos adicionales de quitosano a 2916 cm-1 y 2864 cm-1 debido al estiramiento del enlace CH del carbono sp3, 1634 cm-1 debido al estiramiento del carbonilo C=O de la amida, 1533 cm-1 debido a la flexión de NH y 1066 cm-1 debido a la tensión de los diferentes enlaces CO. La muestra de GEO-NPCH revela pequeños picos asociados con la presencia de GEO. A 3082 cm-1, un pico asociado con la tensión asimétrica del enlace CH para un carbono sp2, 1422 cm-1 debido a la deformación CH del enlace Csp2-H y un pico fuerte a 1087 cm-1 como consecuencia del estiramiento del grupo S=O. 9. Propiedades térmicas de las nanopartículas de GEO-quitosano Se utilizó análisis termogravimétrico/calorimetría diferencial de barrido (TGNDSC) para evaluar el material absorbido, la estabilidad térmica y las temperaturas de escomposición del GEO, NPCH y GEO-NPCH. GEO es un compuesto extremadamente volátil que comienza a evaporarse incluso a temperaturas muy bajas, como se muestra en su TGA y DSC (Figura 2) . Esta pérdida de masa se vuelve más importante a medida que aumenta la temperatura, hasta la evaporación completa de GEO a 125 °C. La Figura 3 muestra los TGA de NPCH y GEO-NPCH. NPCH muestra dos pasos de degradación, el paso inicial que comienza desde el comienzo del experimento y termina a 100 °C y el segundo comienza a 170 °C hasta 333 °C. La primera transición corresponde a una caída de masa del 3, 5% y se atribuye a la pérdida de vaporización de agua/humedad adsorbida/unida. Para confirmar este hecho, se calentó NPCH durante 1 hora a 50 °C bajo atmósfera de nitrógeno y posteriormente se enfrió bajo nitrógeno hasta que se alcanzó la temperatura ambiente. Después de 1h bajo atmósfera de nitrógeno, el termograma no mostró este primer paso de pérdida de agua (Figura 4, línea roja) . La segunda etapa de degradación fue una pérdida de peso del 60% y se debe a la degradación del biopolímero de quitosano puro. Esto se ha observado previamente para otros polímeros de quitosano, donde la cantidad de humedad y el rango de temperaturas de degradación dependen del peso molecular del polímero de quitosano (Szymanska & Winnicka, 2015) . Estas mismas transiciones se observan en el termograma GEO-NPCH (Figura 3, línea azul) , coincidiendo en los rangos de temperatura. En la segunda transición, la pérdida de masa fue del 58%, coincidiendo con el grado de descomposición de NPCH. Por otro lado, en la primera transición, la pérdida de masa es mayor, alcanzando el 7% y, aunque el agua absorbida por ambas partículas puede diferir, esto puede indicar que esta pérdida del 7% podría corresponder no solo a la pérdida de agua sino a la pérdida de GEO. Estos datos fueron confirmados por DSC de NPCH y GEO-NPCH como se muestra en la Figura 4. De manera similar, para TGA, se observan dos transiciones en ambos compuestos. Una endotérmica entre -25 °C y 100 °C, y una segunda, más compleja, entre 170 °C y 300 °C, combinando procesos endotérmicos y exotérmicos, propios de la descomposición del polímero de quitosano. Para la primera transición, existe una diferencia considerable entre las entalpías de evaporación NPCH y GEO-NPCH. Para NPCH, se ha determinado una entalpía de 145 J/g mientras que GEO-NPCH muestra un valor más alto, alcanzando 185 J/g, lo que indica que las nanopartículas cargadas con GEO necesitan más energía para evaporar tanto el agua como el GEO. El GEO encapsulado se descompuso a una temperatura más alta que el GEO libre, lo que refleja la estabilidad térmica mejorada del GEO mediante la encapsulación en nanopartículas de quitosano. 10. Cristalinidad de nanopartículas de GEO-quitosano La estructura cristalográfica del polvo de quitosano, NPCH y GEO-NPCH con una relación CH:GEO de 1:0, 75 se determinó por XRD y se presenta en la Figura 5. El polvo de quitosano exhibe un pico acusado a 20 alrededor de 22° mostrando un alto grado de cristalinidad (Hosseini et al., 2013) . Los patrones de NPCH XRD revelaron un pico amplio causado por la reacción de entrecruzamiento entre el quitosano y el TPP, que da como resultado la formación de una estructura amoría, lo que refleja la destrucción de la estructura de empaquetamiento de quitosano nativo como se describe en otros estudios de patrones de XDR de NP de quitosano. Contrariamente al estudio realizado por Hosseini et al., con respecto a la encapsulación del aceite esencial de orégano (OEO) , donde la incorporación de OEO resultó en un cambio en la estructura de empaquetamiento de quitosano-TPP, la inclusión de GEO en las NP de quitosano no produjo cambios en su cristalinidad en comparación con NPCH. 11. Efectos de GEO-NPCH en semillas revestidas Para estimar el efecto de GEO-NPCH en diferentes tipos de semillas, se evaluó un lote compuesto por 100 semillas de trigo, avena y cebada, determinándose la tasa de germinación después de 7 y 15 días de tratamiento utilizando GEO-NPCH, Tebuconazol (TB) y semillas no tratadas como control (Tabla 2) . A los 7 días, la mayor tasa de germinación se observó en la cebada, donde todos los tratamientos alcanzaron valores cercanos al 99% de germinación, como ocurrió con las semillas no tratadas. En avena, GEO-NPCH mostró una mayor tasa de germinación, alcanzando el 99, 7% en comparación con TB, donde el efecto sobre la germinación fue como en las semillas no tratadas. Por otro lado, las semillas de trigo no tratadas mostraron una tasa de germinación del 82%. A su vez, TB y GEO-NPCH alcanzaron mayores tasas de germinación con 93, 0% y 90, 3% respectivamente. Tabla 2 Por el contrario, el lote de semillas evaluado a los 15 días (Fig. 6) mostró diferentes cambios morfológicos según el tratamiento utilizado. Las semillas tratadas con TB consumieron todos los recursos energéticos, como ocurre en otras especies como el maíz donde los tratamientos convencionales con TB producen reducciones en altura de brote, peso fresco de brote y raíz fresca, señalando que la supresión de la emergencia del maíz inducida por tebuconazol fue exponencialmente dependiente de la dosis. Además, los datos de la Fig. 6 demostraron que GEO-NPCH a 7, 6 mg/ml y dosis de 2 mg/ml tienen un peso total significativamente mayor (p < 0, 05) que las semillas de TB a 10 mg/ml de TB pura. Los tratamientos con NPCH también lograron un aumento significativo (p < 0, 05) en el peso total que las semillas de TB. La longitud de las raíces aumentó significativamente (p < 0, 05) por el tratamiento con GEO-NPCH en comparación con el control no tratado, TB y NPCH. 12. Propiedades antifúngicas de GEO-NPCH La dosis seleccionada utilizada para realizar este experimento fue la misma utilizada en la evaluación de la germinación de la semilla (Ejemplo 11) . Para las actividades antifúngicas, el valor de concentración inhibidora mínima (CIM) de NPCH fue de 10 mg/ml contra F. oxysposum, mientras que los hongos restantes no mostraron inhibición total a esta concentración. Sin embargo, GEO-NPCH fue más eficaz contra F. oxysporum (2, 5 mg/ml) seguido de A. niger y A. versicolor (5 mg/ml) . El tratamiento con GEO fue más efectivo contra A. versicolor (5 mg/ml) , seguido de F. oxysporum 7, 5 mg/ml) y A. niger (10 mg/ml) . El TB fue más efectivo contra el género Aspergillus, siendo más efectiva contra A. niger (0, 25 mg/ml de TB pura) que A. versicolor (0, 5 mg/ml) . La CMI de TB contra F. oxysporum fue la misma que GEO-NPCH (2, 5 mg/ml) . Aunque no se obtuvieron valores de CMI (> 10 mg/ml) contra A. versicolor con ninguno de los tratamientos, incluida la TB, se observó una inhibición significativa cuando se trató con GEO-NPCH a 10 mg/ml. El efecto de los diferentes tratamientos sobre el crecimiento del micelio se muestra en la Tabla 3. Todos los tratamientos mostraron el mismo patrón excepto A. versicolor, que fue resistente a todos los tratamientos incluyendo con TB. A. niger fue el hongo más susceptible con valores de MIC que van desde 0, 11 mg/ml a 1, 11 mg/ml para TB y NPCH, respectivamente. Los valores de CMI obtenidos del tratamiento GEO-NPCH y TB fueron casi similares y mostraron valores bajos de MIC para A. niger y altos para A. versicolor. Tabla 3

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