Patente nacional por "Método para la cuantificación de la función tímica mediante PCR Digital en gota"

Reivindicaciones:
+ ES-2957663_A11.- Método in vitro de obtención de datos útiles para cuantificar la función tímica de un sujeto humano, a partir de una muestra biológica previamente aislada del individuo, que comprende obtener la ratio de Delta-TREC/Beta-TREC mediante su cuantificación simultánea por PCR digital en gota. 2.- El método in vitro de obtención de datos útiles según la reivindicación 1 donde la muestra biológica es sangre. 3.- El método in vitro de obtención de datos útiles según la reivindicación 1 donde la muestra biológica son células mononucleares aisladas de sangre periférica. 4.-El método in vitro de obtención de datos útiles según las reivindicaciones 1 a 3 donde la cuantificación se realiza por fluorescencia. 5.-El método in vitro de obtención de datos útiles según las reivindicaciones 1 a 4 que además comprende: b) comparar el ratio obtenido en el paso con una cantidad de referencia de un individuo sano. 6. Método in vitro para valorar la función tímica, que comprende el método de obtención de datos útiles según cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 7-. Un kit o dispositivo adecuado para realizar los métodos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

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+ ES-2957663_A1 Método para la cuantificación de la función tímica mediante PCR Digital en gota CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN La presente invención se enmarca en el campo de la medicina, concretamente, en la valoración de la función tímica. Se describe un método subrogado para la cuantificación de la función tímica mediante el ratio de los biomarcadores Delta/Beta TREC, aplicando la técnica de PCR digital en gota para su cuantificación. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El timo es un órgano en forma de glándula del sistema inmunológico que produce linfocitos T, células encargadas de la inmunidad celular, cuya función es crítica en la generación y el mantenimiento de un repertorio diverso de linfocitos T, imprescindible para hacer frente a distintos desafíos como infecciones, respuesta a vacunas y control inmunológico frente al desarrollo de tumores. La cuantificación de la función tímica es clínicamente relevante en pacientes con inmunodeficiencias, después de un trasplante de células madre hematopoyéticas, durante la terapia contra el VIH y en pacientes con enfermedades autoinmunes. Existen varias aproximaciones a la valoración de la función tímica mediante métodos de cuantificación subrogados, es decir, sin acceder al tejido del timo, entre los que destacan la cuantificación de biomarcadores obtenidos a partir de muestras de sangre periférica. El objetivo es que estos métodos de cuantificación resulten, además de exactos, mínimamente invasivos. Para ello, se han planteado varios biomarcadores, entre los que destacan por su especial relevancia, los TRECs (T-cell receptor excisión cicles) . Los TREC se consideran un buen marcador molecular de las células recién emigradas del timo (RTE, del inglés "recent thymic emigrant) . Se trata de pequeños fragmentos de ADN circular que se generan durante el reordenamiento de receptores de célula T (TCR) en el timo durante la producción de linfocitos T. Durante el proceso de diferenciación intratímica de los timocitos, para la generación de los diversos receptores de células T (TCR) , se produce un reordenamiento aleatorio de segmentos génicos V, D y J de su ADN, inicialmente separados en el cromosoma, para formar nuevas proteínas, propias de cada posible TCR. Estos segmentos on reunidos por mecanismos de corte y empalme del DNA y dan lugar, como subproducto, a la salida del ADN espaciador en forma de una molécula de ADN circular extracromosómica que recibe el nombre de TREC. Este marcador permite, por tanto, cuantificar la producción de nuevas RTE. Los TRECs tienen la característica fundamental de no dividirse durante los procesos mitóticos y, como consecuencia, ser elementos muy estables y conservados. La cuantificación de dichos TRECs en sangre periférica mediante técnicas de diagnóstico molecular, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , permite valorar la eficiencia de la función tímica, siendo un biomarcador válido para medir la reconstitución de la respuesta mediada por linfocitos T. En concreto Delta TREC es un marcador ampliamente conocido y bastante sencillo de detectar y, por tanto, muy utilizado en estudios de la función tímica (Gomes JAN et al.2020) . Sin embargo, se ha observado que la cuantificación de este marcador por si solo en sangre periférica no resulta del todo fiable debido al sesgo que supone su dilución durante la proliferación en periferia de las células que los portan, ya que los RTE pueden proliferar en respuesta a estímulos homeostáticos, incluso sin mediación del TCR, o bien pueden sufrir apoptosis u otros tipos de muerte celular asociadas a distintas situaciones patológicas. Por tanto, este biomarcador, utilizado de forma individual, aporta resultados que presentan un amplio margen de error. Para superar estas limitaciones, el trabajo de Dion (Dion et al. 2007) propuso como método "gold standard" utilizar células de sangre periférica y calcular en ellas el cociente Delta/Beta-TREC. Su propuesta permitía evaluar la función tímica en humanos, de forma cuantitativa y no invasiva, mediante la estimación de la proliferación de células T precursoras intratímicas, a través de la cuantificación de distintas moléculas TRECs, en concreto, Delta TREC y Beta TREC, en células sanguíneas periféricas. Esta aproximación supone importantes ventajas respecto a otras opciones, como la cuantificación de forma aislada de Delta-TREC o la cuantificación de determinadas células procedentes del timo por citometría de flujo, como las recientes emigrantes del timo (RTE) o las células T vírgenes (Gomes JAN et al. 2020; Courivaud C. et al. , 2020) . El cociente Delta /Beta TREC, a diferencia de estos otros biomarcadores, se mantiene estable en las células, a pesar de que estas proliferen en periferia, ya que este cociente se genera durante la reordenación génica de la cadena beta en un estadío intratímico inmaduro, entre la eordenación génica de la cadena beta y la de la cadena alfa, por lo que con esta medida se logra superar las limitaciones que supone la cuantificación aislada de Delta TREC. Por su parte, Beta-TREC es un biomarcador escaso en la sangre periférica y de difícil cuantificación (Clave E. et al. 2013) . Únicamente es posible encontrarlo en concentraciones elevadas en muestras de cordón umbilical o en biopsias de tejido tímico. Para llevar a cabo esta cuantificación del cociente Delta/Beta-TREC, Dion utiliza la PCR a tiempo real (qPCR) . El método propuesto por Dion es muy complejo, tedioso y precisa de muchas reacciones secuenciales, por lo que además resulta muy costoso. Prueba de su difícil puesta en práctica es la ausencia de estudios posteriores donde se lleve a cabo esta técnica de cuantificación, tal y como se propone en el trabajo de Dion. Posteriormente, se trató de simplificar el método propuesto por Dion, en trabajos como el de Ferrando-Martínez (ES2331499) , donde se trataba de minimizar el número de reacciones secuenciales necesarias. En él se describe un procedimiento para la determinación de la funcionalidad del timo humano basado en el cálculo del cociente entre el contenido de TREC de tipo Delta y Beta, que incluye etapas de amplificación simultánea de más de un TREC de tipo Beta o de tipo Delta mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR multiplex) y se describe a su vez el conjunto de cebadores asociado para su puesta en práctica. Sin embargo, este método seguía siendo muy complejo y difícil de poner a punto. La PCR digital (ddPCR) , de reciente desarrollo, ha permitido dar un paso más en la simplificación del método de cuantificación del ratio Delta/Beta-TREC, con una mejora importante de la sensibilidad y de la precisión, y el consiguiente ahorro en tiempo y reactivos. A diferencia de la PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) , la PCR digital en gota (ddPCR) permite encapsular el material genético en microgotas en las que se realiza la amplificación de una única hebra de ADN de manera independiente, ofreciendo una respuesta lineal al número de copias presentes de cada gen. Esto hace posible, entre otras ventajas, la cuantificación absoluta de las copias generadas, sin depender de referencias o patrones. Además, la técnica de ddPCR permite amplificar los dos genes de estudio simultáneamente en una misma reacción, sin necesidad de llevar a cabo los pasos previos de pre­ amplificación del material genético que precisa la qPCR empleada hasta ahora. Hasta la fecha los intentos de cuantificar Delta TREC mediante la técnica de ddPCR, (Profaizer T, 2020) han requerido la presencia de un gen de referencia para ser utilizado como patrón con el que normalizar la cuantificación realizada. Así pues, se mantiene parte de la complejidad del método inicial, sobre todo en lo referido a los cálculos que es preciso llevar a cabo para la cuantificación, y se introduce una potencial fuente de errores, tanto en la manipulación de las muestras para la amplificación del gen de referencia, como en el cálculo. Por su parte, la cuantificación de Beta TREC, el otro biomarcador necesario para el cálculo del ratio Delta/Beta TREC, ha supuesto una dificultad adicional a la puesta en práctica del método propuesto por Dion. Existen numerosos polimorfismos de Beta TREC, lo que dificulta el trabajo de cuantificación de cada una de sus variantes. En consecuencia, el uso de la ratio Delta/Beta TREC ha sido muy limitado en los estudios llevados a cabo hasta la fecha, a pesar de haberse destacado este ratio como método "gold standard". La mayor parte de estos estudios han renunciado a la cuantificación de Beta TREC debido a su complejidad, y han optado por cuantificar únicamente Delta TREC, con las limitaciones de esta cuantificación anteriormente expuestas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El método aquí descrito, en adelante método de la invención, permite la determinación de la ratio Delta/Beta TREC como marcador subrogado de función tímica mediante el uso de la PCR digital en gota (ddPCR) . El método de la invención permite la cuantificación precisa de la función tímica mediante el uso de la ratio Delta/Beta TREC, simplificando el método de cuantificación planteado por Dion mediante el uso de ddPCR, lo que mejora de forma importante la sensibilidad y la precisión del mismo, y permite un ahorro en tiempo y reactivos. A diferencia de los métodos descritos en el estado de la técnica, el método de la invención no precisa del uso de una recta patrón o gen de referencia, con lo que se reduce el tiempo de ejecución y se minimizan los errores de cálculo, al punto de que el propio software de análisis es capaz de facilitar directamente la ratio Delta /Beta TREC. Así pues, el cálculo obtenido resulta mucho más preciso que los obtenidos por otros métodos. Tampoco es necesario llevar a cabo una preamplificación previa por PCR convencional, gracias al aumento de sensibilidad de la técnica. Esto implica que el método resultante sea inalmente mucho más corto, simplificado y fiable. El método de la invención, además de consumir menos tiempo que el resto de métodos del estado de la técnica anterior, minimiza la posibilidad de errores al tener menos pasos y no precisar de cálculos adicionales. La cuantificación de ambos biomarcadores, Delta TREC y Beta TREC, se lleva a cabo de forma simultánea en una única reacción, lo que reduce la posibilidad de errores de cuantificación que pudieran ocurrir derivados de diferentes condiciones de puesta en práctica en la cuantificación de cada marcador. La disponibilidad de cebadores para la amplificación de los biomarcadores ya conocidos en el estado de la técnica (ES2331499) , junto con el resto de los aspectos ya mencionados en los que se simplifica el método de cuantificación, permite que el método de la invención sea fácilmente reproducible. Respecto a la sensibilidad del método, ésta se ha probado experimentalmente en la determinación de los biomarcadores Delta TREC y Beta TREC de forma simultánea y en la medida final de la ratio Delta/Beta TREC. Con todo ello se ha logrado obtener un método para la determinación de la ratio Delta/Beta TREC que supera todas las limitaciones de los métodos propuestos con anterioridad. Un primer aspecto de la invención se refiere al método, un método in vitro de obtención de datos útiles para cuantificar la función tímica de un sujeto humano, a partir de una muestra biológica previamente aislada del individuo, que comprende obtener la ratio de Delta-TREC/Beta-TREC mediante su cuantificación simultánea por PCR digital en gota. En una realización preferida la muestra biológica es sangre. En otra realización preferida la muestra biológica son células mononucleares aisladas de sangre periférica. En una realización aún más preferida la cuantificación se realiza por fluorescencia. En una realización aún más preferida el método de la invención además comprende comparar el ratio obtenido en el paso con una cantidad de referencia de un individuo sano. Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para valorar la función tímica, que comprende el método de obtención de datos útiles de la invención Los métodos de la presente invención se puede aplicar con muestras de individuos de cualquier sexo, a cualquier edad y condición física. El término "individuo", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere a animales, preferiblemente mamíferos, y más preferiblemente, humanos. Los términos "individuo" "sujeto humano" y "sujeto" se usan indistintamente en esta memoria y son sinónimos de "paciente", y no pretende ser limitativo en ningún aspecto. Los niveles de referencia pueden ser determinados mediante la medición de los niveles de expresión, y esos niveles de referencia se pueden ajustar a las poblaciones específicas (por ejemplo, un nivel de referencia puede estar relacionada con la edad, por lo que las comparaciones se puede hacer entre los niveles de expresión en las muestras de los sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para una enfermedad particular, el fenotipo, o falta de ella en un determinado grupo de edad) . En una realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de varios sujetos en general, o de sujetos sanos. El experto en la técnica apreciará que el tipo de muestra de referencia puede variar dependiendo del método específico a realizar. El perfil de expresión en la muestra de referencia de preferencia puede ser generado a partir de una población de dos o más personas. La población, por ejemplo, pueden contener 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más personas. KIT O DISPOSITIVO DE LA INVENCIÓN Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo adecuado para realizar cualquiera de los métodos de la invención que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar con Delta-TREC y Beta-TREC en condiciones rigurosas o de astringencia. La astringencia es un término usado en experimentos de hibridación. La astringencia refleja el grado de complementariedad entre el oligonucleótido y el ácido nucleico; cuanto mayor sea la astringencia, mayor porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. El experto en la materia sabe bien que la temperatura y las concentraciones de sal tienen un efecto directo sobre los resultados que se obtienen. Se reconoce que los resultados de la hibridación están relacionados con el número de grados por debajo de la Tm (temperatura de fusión) del ADN en el que se realiza el experimento. El kit o dispositivo de la invención puede usarse y el uso no está particularmente limitado, aunque se prefiere el uso en el método de la invención en cualquiera de sus realizaciones. AUTOMATIZACIÓN DE LOS MÉTODOS DE LA INVENCIÓN La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento. En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa, estando el circuito integrado adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de, los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible. Por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que podría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. Otro aspecto de la invención se refiere a una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Reportes generados por el software QuantaSoft 1.7.4 de BIORAD. La primera imagen corresponde a una muestra de biopsia tímica (control positivo) , la segunda a una muestra sin ADN (control negativo) y la tercera a una muestra de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) . Como se puede observar, se recoge la fluorescencia de ambas sondas, Delta-TREC (HEX) y Beta-TREC (FAM) , simultáneamente para cada muestra. Figura 2. Se representa la función tímica (como ratio Delta/Beta-TREC) media en los distintos grupos de muestras analizadas y su significación estadística. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se ha extraído ADN extraído de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMCs) obtenidas por venopunción de 5 individuos sanos y de 5 individuos sometidos a trasplante renal. De forma paralela se han utilizado 5 muestras de biopsias de timo humanas como controles positivos. Tabla 1: Reactivos: cebadores y sondas utilizadas Protocolo de ddPCR Para la preparación de la reacción de la PCR digital en gota (ddPCR) se utilizaron 150 ng ADN por reacción, 10 l Supermix para ddPCR no UDP de BIORAD, 1 M de cada Primer Forward para Beta-TREC, 2 M de Primer Reverse para Delta-TREC, 2 M Primer Forward para Delta-TREC y 2 M Primer Reverse para Delta-TREC. Se completó con agua milli-Q hasta un volumen final de 20 l/reacción. Posteriormente se procedió a la generación de gotas mediante el sistema automático Auto Droplet Generator de BIORAD. Se llevó a cabo una reacción de PCR convencional en un termociclador C1000 Touch Thermal Cycler de BIORAD, según las siguientes condiciones: - 95°C 10 minutos - 60 ciclos de 94°C 30 segundos y 58°C 1 minuto - 98°C 10 minutos - Enfriar la reacción a 4°C hasta el momento de la lectura Se cuantificó la fluorescencia FAM/HEX simultáneamente, en cada gota de la reacción de ddPCR, mediante el lector QX200 Droplet Reader de BIORAD. Se procedió al análisis y cálculo de los resultados mediante software QuantaSoft 1.7.4 de BIORAD. Resultados Mediante el software descrito, se obtienen reportes de datos como los que se muestran en la Figura 1. Mediante el método de la invención se han analizado distintas muestras de ADN, obtenidas de la sangre de individuos sanos y de individuos con trasplante renal (n=5 por grupo) , así como de biopsias de timo humanas (n=5) , como controles. Se muestran los datos individuales en la Tabla 2 y se resumen dichos datos en la Figura 2. Tabla 2. Se representan los valores del número de copias de Beta-TREC y de Delta-TREC obtenidos, en diversas muestras de ADN procedentes de células mononucleares aisladas de sangre periférica (PBMCs) de receptores de trasplante renal (TX) y de individuos sanos (Sano) . Como control positivo (C+) , para la validación del experimento, empleamos ADN extraído a partir de biopsias de timo pediátricos. Se observa claramente la diferencia de valores del ratio Delta/Beta-TREC entre individuos sanos y receptores de trasplante renal. Estos últimos refieren ratios de Delta/Beta-TREC similares a los del control positivo. Referencias 1 . Gomes JAN. et al. Decrease in naive T cell production due to HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) development. Immunobiology. 2021 Jan;226 (1) :152050. doi: 10.1016/j.imbio.2020.152050. Epub 2020 Dec 3. PMID: 33338979. 2. Dion ML et al. Estimating thymic function through quantification of T-cell receptor excision circles. Methods Mol Biol 2007; 380:197-213. 3. Courivaud C. et al. Pre-transplant Thymic Function Predicts Is Associated With Patient Death After Kidney Transplantation. Frontiers in Immunology 11, 2020. DOI=10.3389/fimmu.2020.01653. 4. Clave E. et al. Thymic function recover y after unrelated donor cord blood or T-cell depleted HLA-haploidentical stem cell transplantation correlates with leukemia relapse. Frontiers in Immunology, 4, 2013. 5. Profaizer T et al. A Multiplex, Droplet Digital PCR Assay for the Detection of T-C6ll Receptor Excision Circles and Kappa-Deleting Recombination Excision Circles. Clin Chem. 2020 Jan 1; 66 (1) :229-238. doi: 10.1373/clinchem.2019.308171. PMID: 31672859.

Publicaciones:
ES2957663 (23/01/2024) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
Eventos:
En fecha 15/06/2022 se realizó Registro Instancia de Solicitud
En fecha 15/06/2022 se realizó Admisión a Trámite
En fecha 15/06/2022 se realizó 1001P_Comunicación Admisión a Trámite
En fecha 24/06/2022 se realizó Superado examen de oficio
En fecha 10/05/2023 se realizó Realizado IET
En fecha 12/05/2023 se realizó 1109P_Comunicación Traslado del IET
En fecha 23/01/2024 se realizó Publicación Solicitud
En fecha 23/01/2024 se realizó Publicación Folleto Solicitud con IET (A1)
Pagos:
15/06/2022 - Pago Tasas IET