Patente nacional por "USO DE UN PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA FOTÓNICA SECUENCIAL PARA FOMENTAR LA FOTOPROTECCIÓN Y REGENERACIÓN CUTÁNEA"

Reivindicaciones:
+ ES-2956376_A11. Uso de un proceso de transferencia fotónica secuencial entre compuestos orgánicos por el que se absorben fotones de luz ultravioleta, específicamente UVB y UVA (entre 280 y 400 nm) y se convierten en fotones de luz roja (entre 620 y 780 nm) acoplado a la producción de especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species; ROS) por estimulación con la luz roja resultante del proceso de un compuesto fotosensible/ fotosensibilizador. 2. Uso, de acuerdo con la reivindicación 1 de este proceso de transferencia fotónica secuencial en el que el compuesto fotosensible/fotosensibilizador es la Protoporfirina IX. 3. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 y 2 de este proceso de transferencia fotónica secuencial para activar la producción transitoria de niveles no letales de ROS en células y tejidos de mamífero. 4. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 y 3 de este proceso de transferencia fotónica secuencial para activar la producción transitoria de niveles no letales de ROS en piel de mamífero promoviendo una estimulación fisiológica de la homeostasis y regeneración del tejido a través de la activación de los programas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre del tejido y de células ya diferenciadas en la epidermis y la dermis. 5. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4 de este proceso de transferencia fotónica secuencial en piel humana para la reparación o mejora de los efectos adversos sobre la piel del estrés diario, exposición solar o a contaminantes ambientales, y el envejecimiento del tejido, prematuro o no. 6. Una composición que contiene una combinación de compuestos orgánicos capaces absorber luz UVB/A (280-400 nm) y emitir luz azul azul/verde (450 y 570 nm) y compuestos orgánicos capaces absorber luz azul/verde y emitir luz roja (entre 620 y 780 nm) que permita promover una transferencia fotónica secuencial a partir de fotones de luz UVB/A para generar fotones de luz roja. 7. La composición para uso de acuerdo con la reivindicación 6 en la que los compuestos orgánicos pertenecen a los grupos químicos de polifenoles, flavonoides, cannabinoides, arotenos, xantenos, clorofilas o ácidos oleicos. 8. La composición para uso de acuerdo a las reivindicaciones 6 y 7 que contiene además un compuesto fotosensible, o precursores del mismo, capaz de absorber luz roja y producir ROS, preferiblemente PpIX o sus precursores. 9. Una composición cosmética o farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 6, 7 y 8 para uso en tratamientos que implican detener, revertir, mejorar, disminuir y/o reducir defectos, imperfecciones o condiciones poco estéticas de la piel, que incluyen, pero no se restringen a: arrugas finas o profundas, estrías, patas de gallo, ojeras, pérdida de cabello, arañas vasculares, hiperpigmentación, hipopigmentación, decoloración, manchas de edad, pérdida de brillo cutáneo, pecosidad, imperfecciones, fragilidad tisular, sequedad, grietas, rugosidad táctil, acné, rosácea, dermatitis atópica, psoriasis y eczemas. 10. Una composición cosmética o farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 6, 7 y 8 para uso en tratamientos que implican detener, revertir, mejorar, disminuir y/o reducir los efectos de la radiación solar en la piel humana, incluyendo quemaduras y manchas solares. 11. Una composición cosmética o farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 6-10 para uso tópico en piel humana en el que los componentes que promueven la transferencia fotónica secuencial acoplada la producción de ROS se encuentren incorporados en sistemas de vehiculización o sistemas de liberación sostenida cosmética o farmacéuticamente aceptable desde un punto de vista fisiológico, seleccionado del grupo formado por liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfolípido-tensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, nanopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas y soportes lipídicos nanoestructurados. 12. Una composición cosmética o farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 6-11 que se presente en una formulación seleccionada del grupo formado por cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, erums, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, cápsulas duras, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, formas granuladas, gomas de mascar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, films de polisacáridos, jaleas y gelatina. 13. Una composición cosmética o farmacéutica de acuerdo a las reivindicaciones 6-11 que se encuentra incorporada a un producto seleccionado del grupo formado por correctores de ojeras, fondos de maquillaje, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, sombras de ojos, barras de labios, brillos labiales, protectores labiales y polvos.

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+ ES-2956376_A1 USO DE UN PROCEDIMIENTO DE TRANSFERENCIA FOTÓNICA SECUENCIAL PARA FOMENTAR LA FOTOPROTECCIÓN Y REGENERACIÓN CUTÁNEA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuadra en el ámbito de la biotecnología y se refiere al uso de un procedimiento de transferencia fotónica secuencial, basado en composiciones que combinan compuestos orgánicos capaces de absorber luz solar ultravioleta (UV) para convertirla en luz roja, fomentando la fotoprotección frente a la radiación solar y la regeneración cutánea de amplio espectro. El efecto fotoprotector se debe a los compuestos de estas composiciones capaces de absorber luz UV, mientras que el efecto regenerador se debe a la emisión final de luz roja de la combinación de compuestos, que, por último, activa en el tejido una producción transitoria de niveles no letales de especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species; ROS) suficiente para estimular los programas de homeostasis y regeneración del mismo. ANTECEDENTES El adecuado cuidado y mantenimiento de la piel en respuesta a multitud de situaciones patológicas con gran incidencia en la población (cáncer melanoma y no melanoma, infecciones bacterianas y víricas, agresiones por agentes físico/químicos, úlceras crónicas en personas mayores o diabéticas, heridas quirúrgicas de larga duración, psoriasis, dermatitis atópica y muchos otros) es un reto fundamental para el sistema de salud con enormes repercusiones sociales y económicas, sobre todo en lo referido a la tercera edad. Las afecciones de órganos adyacentes de la piel como el folículo piloso o las glándulas sudoríparas, así como los procesos de degradación gradual del tejido asociados al envejecimiento o a la continuada exposición a contaminantes ambientales, aún sin suponer en muchos casos una amenaza directa para la salud del paciente, tienen también una gran incidencia social con una correspondiente cuota de mercado en crecimiento continuo. Mención aparte merece la exposición continuada de la piel a la radiación solar, que genera daños acumulativos en el tejido que pueden derivar en patologías graves como el cáncer melanoma. En este contexto, y debido a sus enormes repercusiones sociales, el mercado del cuidado de la piel en general, a nivel clínico y cosmético, es uno de los sectores con mayor alza continuada a nivel mundial y se espera un incremento exponencial en los próximos años. Dentro de la vertiente biotecnológica de este mercado las mayores revisiones de crecimiento son la cosmética y la medicina regenerativa con aplicaciones dermocosméticas y clínicas. En este ámbito, muchas de las terapias/tecnologías/productos disponibles actualmente en el mercado para tratar un importante grupo lesiones y afecciones cutáneas, tanto a nivel clínico como cosmético, presentan importantes carencias y limitaciones funcionales que afectan de forma crítica a su eficacia real, y definen, a su vez, nichos concretos y nuevos para I+D+i. A nivel clínico: • Cicatrización de lesiones cutáneas de larga duración. El coste económico de las úlceras crónicas en personas mayores o diabéticas, de heridas quirúrgicas o domésticas de larga duración se mide en miles de millones de euros, constituyendo aproximadamente un 8-10% del gasto total del sistema de salud, una figura que se incrementa de forma constante debido al envejecimiento de la población. No existe un tratamiento curativo efectivo para este tipo de lesiones, siendo el tiempo de hospitalización (50%) y el gasto en cuidados de enfermería (30-35%) las mayores cargas económicas para el sistema. A nivel cosmético: • Protección solar y regeneración cutánea antienvejecimiento de alta eficiencia y ecosostenible basada en compuestos de origen natural. Una de las tendencias prioritarias actuales del sector es el respeto al medioambiente y el uso de compuestos naturales/orgánicos. La mayoría de los fotoprotectores solares actuales contienen filtros físicos (e. g. dióxido de titanio) o químicos (e.g. oxibenzona, avobenzona, octisalato, octocr y lene, homosalato, octinosato) , compuestos sintéticos que pueden afectar al paciente y al medio ambiente. Por su parte, el objetivo de las composiciones regeneradoras y antienvejecimiento es la protección y reparación simultánea de la piel y el incremento de su firmeza y tersura. Las composiciones de este tipo presentes en el mercado son en su mayoría cremas hidratantes simples que contienen diversos tipos de moléculas adicionales, normalmente sintéticas, como retinoides, coenzima Q10, antioxidantes, factores de crecimiento, colágenos, alfa y beta hidroxiácidos o péptidos como Argilerine o Matr y xil. En la mayoría de los casos, el efecto de estas cremas a nivel de reparación y regeneración de la piel es escaso debido fundamentalmente a que los teóricos principios activos tiene una baja penetrabilidad a través de la barrera epidérmica, o la atraviesan, ero son rápidamente degradados, o la atraviesan, pero son modificados perdiendo efectividad. En estos dos nichos existe claramente la oportunidad de innovación y desarrollo de productos competitivos que cubran necesidades esenciales para un sector muy amplio de la población. En ambos casos los procesos biológicos subyacentes son el mantenimiento homeostático y la regeneración de la piel, que dependen fundamentalmente de la actividad regulada de las células madre del tejido. Por ello, una de las líneas de desarrollo con más potencial a nivel terapéutico o cosmético en dermatología es el desarrollo de nuevas tecnologías que permitan una regulación funcional eficaz de las células madre de la piel. Por otro lado, las especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species; ROS) son intermediarios moleculares altamente reactivos e inestables que resultan de la reducción del oxígeno molecular (O2) para formar agua (H2O) durante el metabolismo aerobio en mamíferos (Ray et al., Cell Signal. 24:981, 2012) . En los todos los sistemas biológicos la producción de ROS presenta un efecto hormético, de modo que su acumulación por encima de un umbral crítico es tóxica, mientras que en concentraciones por debajo de este umbral pueden funcionar como moléculas señalizadoras. Así, la acumulación excesiva y recurrente de estos compuestos en células y tejidos induce estrés oxidativo, involucrado causalmente en el desarrollo de múltiples enfermedades, incluyendo cáncer, y en el proceso de envejecimiento (Finkel., Curr Opin Cell Biol 15; 247, 2003; Valko et al., Int J Biochem Cell Biol. 39:44-84, 2007; Shi et al. Antioxid Redox Signal. 16:1215-28, 2012; Pandya et al., Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatr y . 46:214-23, 2013) . Sin embargo, en los últimos años se ha demostrado que, efectivamente, en condiciones fisiológicas normales, bajos niveles de ROS pueden jugar papeles esenciales funcionando como segundos mensajeros, estando implicadas en la regulación de procesos fisiológicos como proliferación, diferenciación y supervivencia celular. Chiarugi, Mol Cells. 26:329-37, 2008; Bartosz., Biochem. Pharmacol. 77:1303, 2009; Sena and Chandel., 2012; Ray et al., Cell Signal. 24:981, 2012; Espada and Martín-Pérez., Int. Rev. Cell. Mol. Biol. 331:83, 2017) . En este contexto, en los últimos años se ha demostrado que las ROS actúan como segundos mensajeros que regulan mecanismos moleculares en los procesos de homeostasis y regeneración de la piel en mamíferos. Así, la activación controlada de la producción en el tejido de niveles no letales de ROS promueve la activación de los rogramas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre residentes, estimulando procesos fisiológicos como la cicatrización de quemaduras y heridas o el crecimiento del pelo (Carrasco E, et al. J. Invest. Dermatol. 135:2611, 2015; Carrasco E, et al. Methods 109: 180, 2016; Calvo-Sánchez MI, et al. Rep. 2019 DOI: 10.1038/s41598-019-39992-8) . Esta activación controlada de ROS en el tejido se lleva a cabo mediante un proceso fotodinámico que utiliza un compuesto fotosensible o fotosensibilizador y luz de una longitud de onda adecuada para producir ROS a partir del oxígeno molecular (Figura 1A) . En concreto, este proceso fotodinámico está dirigido a estimular la activación de una producción controlada de ROS por el fotosensibilizador endógeno Protoporfirina IX (PpIX) , presente en todas las células eucariotas. Este proceso fotodinámico requiere la incorporación al substrato biológico de precursores de la PpIX, como el aminoácido natural ácido aminolevulínico (ALA) , o su precursor metilado, metil-aminolevulinato (mALA) , con objeto de incrementar los niveles celulares basales de PpIX, y la posterior irradiación con luz roja, que fotoestimula específicamente a la PpIX para producir ROS (Figura 1B) . La combinación de una adecuada concentración de precursores y dosis de luz permite controlar de forma regulada la activación de los mecanismos de homeostasis y regeneración cutánea en tejidos in vivo (Carrasco E, et al. J. Invest. Dermatol. 135:2611, 2015; Carrasco E, et al. Methods 109: 180, 2016; Calvo-Sánchez MI, et al. Rep. 2019 DOI: 10.1038/s41598-019-39992-8) . Un aspecto fundamental de este proceso fotodinámico que constituye una limitación crítica para la implementación de procesos/métodos o el desarrollo de productos para fomentar la homeostasis y regeneración cutánea a nivel cosmético o farmacológico, es la necesidad de utilizar una fuente autónoma de luz roja aplicada sobre el tejido para fotoestimular intracelularmente la producción de ROS basada en la PpIX, dado que la radiación de luz roja procedente del sol no tiene suficiente potencia para activar el proceso. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el efecto estimulador de las ROS en la piel y se refiere a un proceso de transferencia fotónica secuencial entre compuestos orgánicos por el que se absorben fotones de luz ultravioleta, específicamente UVB y UVA (entre 280 y 400 nm) y se convierten en fotones de luz roja (entre 620 y 780 nm) . Se define "transferencia fotónica" como la absorción de un compuesto orgánico de fotones de determinada longitud de onda y la posterior emisión por parte del compuesto de fotones de longitud diferente, típicamente más larga que la del fotón inicial, que pueden ser subsiguientemente absorbidos por otro compuesto orgánico adyacente para emitir a su vez fotones de longitud de onda aún más larga. La estructura química de cada compuesto determina los correspondientes rangos de absorción y emisión fotónica. Una determinada combinación de compuestos orgánicos puede, en función de sus características químicas, acoplar de forma secuencial la absorción y emisión de fotones de distintas longitudes de onda. La innovación de la presente invención consiste en acoplar un mecanismo de transferencia fotónica secuencial a la activación transitoria de una producción endógena de ROS en sistemas biológicos, particularmente células y tejidos de mamíferos, mediante la fotoestimulación intracelular del compuesto fotosensible/fotosensibilizador endógeno PpIX, presente en todas las células eucariotas, por la luz roja generada en el proceso de transferencia fotónica secuencial (Figura 2) . Se entiende por "compuesto fotosensible/fotosensibilizador" aquel compuesto capaz de producir ROS en presencia de oxígeno al ser irradiado con luz de una longitud de onda adecuada, que es administrado de forma exógena o producido por el propio organismo a partir de un precursor. De forma específica, se plantea un proceso de transferencia fotónica secuencial en la piel para regular y estimular funciones fisiológicas de homeostasis y regeneración cutánea. La transferencia fotónica secuencial en la piel utiliza los fotones de luz UVB/A procedentes de la radiación solar, los mas energéticos que alcanzan la superficie terrestre, para producir por último una elevada generación de fotones de luz roja sobre la superficie de la epidermis, alcanzando la irradiancia suficiente para alcanzar las células de las capas interna de la piel y fotoestimular la PpIX, activando de este modo la producción de niveles no letales, señalizadores de ROS en el tejido. Un primer aspecto de la invención se refiere a una composición que incluye cualquier combinación de compuestos orgánicos capaces de absorber luz UVB/A procedentes de la radiación solar para emitir fotones de luz azul/verde (entre 450 y 570 m) y compuestos orgánicos capaces de absorber luz azul/verde para emitir fotones de luz roja capaces de fotoestimular la PpIX. Esta combinación de compuestos puede incluir precursores de la PpIX, como ALA o mALA, para incrementar la producción y concentración intracelular de esta molécula, potenciando la producción de ROS al absorber luz roja. Otro aspecto de la invención se refiere al uso tópico en piel de la combinación de compuestos orgánicos capaces de promover la transferencia fotónica secuencial entre luz UV y luz roja, y precursores de la PpIX, para promover una estimulación fisiológica del tejido dependiente de ROS, abarcando la activación de los programas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre del tejido y de células ya diferenciadas en la epidermis y la dermis, con aplicaciones cosméticas o farmacéuticas. Estas aplicaciones se refieren a la reparación o mejora de los efectos adversos sobre la piel del estrés diario, exposición solar o a contaminantes ambientales, y el envejecimiento del tejido prematuro o no. Por "reparación o mejora" se entiende detener, revertir, mejorar, disminuir y/o reducir defectos, imperfecciones o condiciones poco estéticas de la piel, que incluyen, pero no se restringen a: arrugas finas o profundas, estrías, patas de gallo, ojeras, pérdida de cabello, arañas vasculares, hiperpigmentación, hipopigmentación, decoloración, manchas de edad, pérdida de brillo cutáneo, pecosidad, imperfecciones, fragilidad tisular, sequedad, grietas, rugosidad táctil, dermatitis atópica, acné, rosácea, psoriasis y eczemas. La reparación y mejora de estos aspectos adversos en la piel dependen de la estimulación de los procesos fisiológicos de homeostasis y regeneración cutánea, que a su vez se basan en la activación regulada de los programas de proliferación y diferenciación de los nichos de células madre del tejido y otros tipos celulares del tejido como fibroblastos, queratinocitos, células de Merkel, células de Langerhans y melanocitos. De forma particular, estas aplicaciones incluyen la estimulación de la producción celular de componentes de la matriz extracelular dérmica, fundamentalmente colágenos y elastinas, para promover la tersura y firmeza de la piel y la eliminación de arrugas, así como la estimulación de los nichos de células madre de la epidermis para promover la regeneración y mantenimiento de tono cutáneo, y la estimulación de los nichos de células madre del folículo piloso para prevenir la caída del cabello o para inducir su crecimiento. Otro aspecto de la invención se refiere al uso tópico en piel de la combinación de compuestos orgánicos capaces de promover la transferencia fotónica secuencial entre luz UV y luz roja para promover la fotoprotección del tejido frente a radiación solar UVB/A para prevenir y/o reparar las quemaduras y manchas solares, así como otros efectos deletéreos de la sobrexposición de la piel a la radiación solar como envejecimiento prematuro del tejido o cáncer de piel. En los EJEMPLOS presentados se demuestra de forma categórica que la combinación de compuestos orgánicos como flavonoides (morina) o cannabinodes (cannabidiol) capaces de absorber luz UVB y emitir luz azul/verde, y clorofilas (clorofila a) , capaces de absorber luz azul/verde y emitir luz roja, en presencia de precursores de la PpIX (mALA) , no solo protege a fibroblastos primarios de dosis letales de radiación UVB, si no que estimula los programas de proliferación y diferenciación de las células y activa la producción de proteínas de matriz extracelular como colágenos y elastina, en un proceso que es dependiente de ROS. Además, se demuestra que los flavonoides o cannabinoides por sí solos son capaces de proteger las células en cultivos frente a radiación UVB, pero no de estimular la proliferación o la síntesis de proteínas de matriz extracelular, mientras que la clorofila por sí misma no es capaz ni de proteger frente a radiación UVB ni de estimular a las células en ningún sentido, lo que implica de facto la existencia de un proceso de transferencia fotónica secuencial que está finalmente acoplado al a producción intracelular de niveles no letales de ROS. Así, una realización preferible de la invención es que entre los compuestos orgánicos que por sus características químicas sean susceptibles de combinarse para generar este proceso de transferencia fotónica secuencial se encuentran, sin restringirse a, polifenoles como flavonoides, cannabinoides (absorben luz UV y emiten luz azul/verde) , xantenos, carotenos, clorofilas y ácidos oleicos (absorben luz verde/azul y emiten luz roja) , y precursores de la PpIX, específicamente ALA y mALA, que aumenten la susceptibilidad de las células a la fotoestimulación endógena de la producción de ROS PpIX-dependiente. Otra realización preferible es que la composición que contenga los compuestos arriba mencionados, se encuentre incorporada a un sistema de vehiculización o a un sistema de liberación sostenida cosmética o farmacéuticamente aceptable desde un punto de vista fisiológico, seleccionado del grupo formado por liposomas, liposomas mixtos, oleosomas, niosomas, etosomas, milicápsulas, microcápsulas, nanocápsulas, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mixtas de tensioactivos, micelas mixtas fosfolípido-tensioactivo, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, microemulsiones, nanoemulsiones, minipartículas, milipartículas, micropartículas, anopartículas, nanopartículas sólidas lipídicas y soportes lipídicos nanoestructurados. Otra realización preferible más es que la composición cosmética o farmacéutica de la invención se presente en una formulación seleccionada del grupo formado por cremas, emulsiones múltiples, composiciones anhidras, dispersiones acuosas, aceites, leches, bálsamos, espumas, lociones, geles, geles crema, soluciones hidroalcohólicas, soluciones hidroglicólicas, hidrogeles, linimentos, sueros, jabones, champús, acondicionadores, serums, ungüentos, mousses, pomadas, polvos, barras, lápices, vaporizadores, aerosoles, cápsulas, cápsulas de gelatina, cápsulas blandas, cápsulas duras, comprimidos, comprimidos recubiertos de azúcar, formas granuladas, gomas de mascar, soluciones, suspensiones, emulsiones, jarabes, films de polisacáridos, jaleas y gelatina. En otra realización preferible, dicha composición se encuentra incorporada a un producto seleccionado del grupo formado por correctores de ojeras, fondos de maquillaje, lociones desmaquillantes, leches desmaquillantes, sombras de ojos, barras de labios, brillos labiales, protectores labiales y polvos. EJEMPLOS MATERIALES Y MÉTODOS -Modelo experimental Para el desarrollo de los ensayos llevados a cabo en este proyecto, se emplearon cultivos primarios de fibroblastos humanos obtenidos a partir de biopsias de piel de voluntarios sanos y regiones de piel sana de pacientes jóvenes (neonatos-13 años de edad) como modelo in vitro. Las biopsias de piel fueron proporcionadas por la Unidad de Dermatología del Hospital Ramón y Cajal, con el consentimiento informado de los pacientes y con la aprobación del Comité Ético del Hospital Ramón y Cajal. Dichas biopsias fueron procesadas mediante disgregación mecánica, empleando bisturí, y enzimática con Colagenasa A (1 mg/ml, Roche) para la digestión del colágeno y disociación celular para la obtención de fibroblastos. -Cultivo y mantenimiento de la línea celular de fibroblastos humanos El cultivo de la línea celular se realizó siguiendo protocolos estándar (Rheinwald & Green, 1975; Magdalena et al., 2003; Ng and Ikeda., 2011) . La línea celular empleada fue crecida en medio de cultivo DMEM ("Dulbecco's Modified Eagle's Medium") sin piruvato (Gibco) , suplementado con 2 mM de L-glutamina Gibco) , 10% de suero fetal bovino (FBS, "Fetal Bovine Serum") (Gibco) y antibiótico con antimicótico diluido al 1X (Gibco) . Todos los cultivos fueron mantenidos a 37°C en una atmósfera húmeda con un 5% de CO2. Se empleó medio de cultivo sin piruvato para el posterior análisis de la liberación de la enzima citoplasmática lactato deshidrogenasa (LDH) proveniente de células muertas y/o lisadas, que cataliza la oxidación del lactato a piruvato, descrito en el apartado 3.10 de materiales y métodos. Para el mantenimiento de la línea celular, así como para los distintos tratamientos llevados a cabo, se emplearon placas Petri de 100 cm2 de superficie (P100, Falcon) así como placas multipocillo de 6 pocillos (MW6, Falcon) , respectivamente, tratadas para la adhesión celular. Las células se mantuvieron a una confluencia del 20-90%, renovándose el medio de cultivo en días alternos y realizándose los subcultivos (al alcanzar un 70-80% de confluencia) mediante la disgregación de las células con Tripsina-EDTA (Sigma-Aldrich) dependiendo del tiempo de duplicación de cada una de las líneas. Además, las células también fueron sembradas sobre cubreobjetos redondos de cristal de 12 mm de diámetro (Superior Marienfeld) colocados en las placas multipocillo de 6 pocillos, para los análisis posteriores de inmunolocalización de proteínas. -Ensayo de daño con luz ultravioleta B en cultivos primarios de fibroblastos humanos. Para la determinación del tiempo necesario para la detección de daño celular tras la irradiación con luz ultravioleta B, se sembraron 700.000 fibroblastos humanos por pocillo en placas de 6 pocillos (MW6, Falcon) , sobre cubreobjetos de cristal. Tras la siembra, los cultivos celulares se mantuvieron en medio completo durante 24 horas hasta alcanzar una confluencia del 80- 90%. Transcurrido este tiempo, se llevó a cabo la irradiación durante 5 minutos con una fuente de luz ultravioleta B de onda de 311 nm (Dermalight 200, Dr Honle Medizintechnik) colocada en la parte superior de la placa, y mantenida a 2 cm de los cultivos celulares. Posteriormente los cultivos se mantuvieron en medio de cultivo DMEM completo durante los siguientes tiempos establecidos: 10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 16 horas, 24 horas y 48 horas. En paralelo se llevaron los controles negativos en ausencia de luz UVB. Transcurrido el tiempo determinado, se llevó a cabo la fijación de las células con formaldehido al 3.7% en PBS para posterior análisis de inmunolocalización de proteínas. -Tratamiento con químicos vegetales (Clorofila A y Morina o Cannabidiol) y metil aminolevulinato (mALA) como precursor del fotosensibilizador endógeno Protoporfirina IX (PpIX) en fibroblastos humanos. Para llevar a cabo los distintos tratamientos, se sembró el mismo número de células (700.000) en placas multipocillo de 6 pocillos (MW6, Falcon) . Tras la siembra, los cultivos celulares se mantuvieron en medio completo durante 24 horas hasta alcanzar una confluencia del 80-90%. Transcurrido este tiempo, se retiró el medio completo y los cultivos celulares fueron incubados con una combinación de 1, 6 mM de Morina (Sigma) o 1 mM de Cannabidiol y 1, 11 mM de Clorofila A (Sigma) y 0, 1 mM de mALA en medio DMEM completo sin FBS durante 4 horas en oscuridad a 37°C en atmósfera húmeda con 5% de CO2. A continuación, las placas de cultivo fueron irradiadas con una fuente de luz ultravioleta B de longitud de onda de 311 nm (Dermalight 200, Dr Honle Medizintechnik) durante 5 minutos. En paralelo se llevaron los controles negativos en ausencia de mALA, clorofila, morina, cannabidiol y de luz. Tras la finalización del procedimiento, se retiró el medio de cultivo, las células se lavaron con PBS ("Phosphate-Buffered Saline") y se mantuvieron en medio DMEM completo fresco hasta su posterior análisis.Todas las placas se mantuvieron en cultivo hasta la recogida de las muestras celulares a las 4, 24 y 48 horas para la realización de los distintos ensayos. -Inmunolocalización de las proteínas vH2AX y Ki67 en las líneas celulares empleadas Para la inmunolocalización de proteínas en fibroblastos humanos crecidos en cubreobjetos de cristal, éstos fueron fijados con formaldehido al 3.7% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente (RT, "Room Temperature") 4, 24 y 48 horas después de los tratamientos descritos en el apartado 3.4. A continuación, los cristales se lavaron con PBS y se añadió Tritón X-100 (0, 5% en PBS, Sigma-Aldrich) durante 30 min para permeabilizar las membranas de las células fijadas. Tras la permeabilización, se bloquearon las uniones inespecíficas con PBS-BSA 0, 5% (albúmina sérica bovina diluida en PBS) durante 30 minutos a RT. Después, las muestras se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente (rabbit-anti- Ki67 y mouse-anti-yH2AX) diluido 1:100 en PBS-BSA O/N a 4 oC en cámara húmeda. Tras lavar las muestras con PBS, se incubaron los cubreobjetos con el anticuerpo secundario correspondiente (Alexa FluorTM 546 goat antirabbit IgG (H+L) o Alexa FluorTM 488 goat anti-mouse IgG (H+L) , Life Technologies) a una dilución de 1:200 en PSB-BSA y DAPI (5 ng/ml, Sigma-Aldrich) para la contratinción e los núcleos celulares durante 1 hora a RT en oscuridad. Finalmente se montaron las muestras con medio de montaje acuoso Prolong (Invitrogen) . Para la observación de las muestras, se empleó el microscopio de fluorescencia Nikon modelo Eclipse Ci-L 100-240V 0.2A 50/60Hz acoplado a una cámara CCD Progress (Gr y phax) mediante la excitación del fluorocromo correspondiente. -Ensayo de viabilidad en cultivo de fibroblastos primarios mediante tinción de cristal violeta Con el objetivo de determinar la viabilidad celular y cuantificar la muerte celular tras los diferentes tratamientos llevados a cabo, se realizó una tinción de las células con cristal violeta (Feoktistova et al. 2016) . Para ello, tras retirar el medio de cultivo en el cual se habían crecido las células, éstas fueron fijadas a las 4, 24 y 48h con Metanol frío (-20°C) durante 10 min a RT. Posteriormente, las células fueron teñidas con Cristal Violeta (0, 1%) durante 40 min RT. A continuación, tras retirar el cristal violeta y lavar con agua corriente el exceso del mismo, se incubaron las placas en estufa a 37°C durante 1h. Por último, para disolver el tinte, se adicionó ácido acético al 10% manteniéndose en agitación durante 15 minutos a RT. Finalmente, la absorbancia fue medida en placas multipocillo de 96 pocillos a 620 nm utilizando el lector de densidad óptica Tecans Sunrise absorbance microplate reader. -Ensayo de viabilidad y estudio de ciclo celular en cultivo fibroblastos primarios humanos mediante análisis por citometría de flujo. Con el fin de determinar viabilidad celular, así como la fase celular en que se encontraban los fibroblastos primarios humanos, tras los distintos tratamientos a las 4, 24 y 48 horas, se realizó una tinción de Yoduro de Propidio (PI, "propidium iodide") . El PI es un compuesto fluorogénico que se une estequimétricamente a los ácidos nucleicos por lo que su fluorescencia es proporcional al DNA y RNA que contiene una célula y que disminuye cuando las células entran en apoptosis (Riccaídi, 2006) . Para ello, los sobrenadantes celulares junto con la suspensión celular recogida mediante tripsinización, fueron centrifugados a 1500 rpm durante 10 minutos, y los pellets celulares obtenidos fueron fijados con etanol 70% frío durante 16 horas a -20°C. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a 200 G (rcf) durante 10 minutos a 4°C y, tras ser lavadas con PBS frío, se resuspendieron en una solución de PBS con la mezcla e tinción siguiente: yoduro de propidio (1mg/ml) , RNasa libre de DNasas (10 ^g/mL) y Tritón 0, 1% (v/v) en PBS. Por último, se trasladaron las muestras a tubos eppendorf de 1, 5 mL y se incubaron a 37°C durante 15 minutos. Las muestras finales se conservaron a 4°C hasta el análisis por citometría de flujo (Servicio de Citometría de la UAM) -Extracción de RNA y análisis de expresión génica Para la determinación de los niveles de expresión de mRNA en los pellets celulares de fibroblastos humanos recogidos mediante tripsinización a las 4, 24 y 48 horas tras los tratamientos realizados, se llevó a cabo la extracción y purificación de RNA a partir de los mismos con el kit RNeasy Mini (Quiagen) , siguiendo las indicaciones de la casa comercial. La concentración y pureza de RNAm se cuantificó determinando su absorbancia, empleando un espectrofotómetro de gota (SimpliNanoTM) , y se llevó a cabo un RT-PCR para la generación de cDNA empleando para ello el kit FastGene Scriptase Basic cDNS Synthesis Kit (NIPPON Genetics EUROPE) . -Cuantificación de la concentración de Colágeno Ia1 Humano en respuesta al tratamiento Con el fin de estudiar la liberación de colágeno Ia1 humano en el medio de cultivo, se utilizó un kit comercial, Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA, 5 Plate, siguiendo las indicaciones de la casa comercial. y empleándose para ello los sobrenadantes obtenidos a partir de los medios de cultivos de las diferentes condiciones experimentales establecidas en el tratamiento realizado. Para ello, los diferentes sobrenadantes fueron expuestos a un anticuerpo de captura mouse Anti-Human Pro-Collagen I a1 y a concentraciones decrecientes de Recombinant Human Pro-Collagen I a1 Standard para el posterior análisis de las concentraciones obtenidas con una curva patrón. A continuación, se llevó a cabo la incubación durante 2 horas a RT y en oscuridad con el anticuerpo de detección, adicionándose posteriormente Estreptavidina-HRP durante 20 min en oscuridad. La determinación de la densidad óptica se llevó a cabo utilizando el lector Tecan's Surnrise absorbance microplate reader a 450 y 570nm. Tras la determinación de las densidades ópticas, se restaron las absorbancias obtenidas a 450 nm y 570nm y se llevó a cabo una recta patrón para interpolar en ella los datos obtenidos de las distintas condiciones. -Determinación de la citotoxicidad celular mediante la cuantificación de la concentración de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) liberada al medio tras el tratamiento Con el objetivo de estudiar la citotoxicidad celular, se determinó la concentración de enzima lactato deshidrogenasa (LDH) , que cataliza la conversión de piruvato mediante la reducción de NAD+ a NADH, liberada al medio de cultivo celular a partir de las células muertas, utilizando el kit CyQUANT™ LDH Cytotoxicity Assay Kit (Invitrogen) siguiendo las indicaciones de la casa comercial y realizándose triplicados de los tratamientos. Consiste en un método colorimétrico basado en la reducción de la sal de tetrazolio (INT) formando cristales de formazán de color rojo, siendo esra proporcional a la cantidad de LDH liberada en el medio y por lo tanto, siendo indicativo de citotoxicidad. La absorbancia se midió utilizando el lector de densidad óptica Tecans Sunrise absorbance microplate reader a 680 y 490nm. Tras la determinación de las densidades ópticas correspondientes, se restaron las absorbancias obtenidas a 490 nm menos las obtenidas a 680nm, obteniéndose el porcentaje de citotoxicidad de cada muestra mediante la siguiente fórmula Fórmula para el cálculo del porcentaje de citotoxicidad asociado a LDH -Métodos estadísticos Para todos los diseños experimentales planteados se incluyó un mínimo de muestras para la obtención de significación estadística (n>3) en las condiciones de control y tratamiento, realizándose una comparación de las variables estudiadas entre control y tratamientos. Todos los datos obtenidos en las distintas mediciones y análisis se introdujeron en un fichero Excel y los valores independientes de cada tratamiento fueron relativizados frente a su control estableciéndose los ratios y comparándose mediante la prueba t de Student, determinándose para muestras métricas o no métricas en base al análisis de la varianza realizado por medio de la prueba t de Fisher. Posteriormente los valores fueron representados en gráficos de barras. Para los análisis estadísticos de los datos de expresión génica obtenidos por PCR, estos fueron introducidos en un fichero Excel y se analizaron mediante el método Ct omparativo, representándose los cambios en la expresión génica como valor 2 - ACt y normalizándose su expresión frente al gen control empleado (18s) . Posteriormente los resultados se representaron en gráficos de barras. RESULTADOS -El daño celular causado por la irradiación con luz UVB en cultivos primarios de fibroblastos humanos comienza a manifestarse a 24h tras la exposición. En primer lugar, para determinar el tiempo en el cual se manifiesta el daño celular inducido por la exposición a irradiación con luz UVB durante 5 minutos en cultivos primarios de fibroblastos humanos, se analizó mediante inmunodetección, el marcador de rotura en la doble hebra de ADN, histona yH2AX, comúnmente empleado como control positivo de daño frente a UV (Hanasoge & Ljungman, 2007; Yuan et al., 2010) , a los distintos tiempos establecidos (10 minutos, 30 minutos, 1 hora, 4 horas, 16 horas, 24 horas y 48 horas) . Los resultados obtenidos indican, tal y como se muestra en la Figura 3, que el daño genómico tras la inducción del mismo con luz UVB comienza a manifestarse con la expresión del marcador yH2AX a las 24 horas, manteniéndose dicha expresión a las 48 horas, y seleccionándose por tanto ambos tiempos para la realización de los ensayos planteados en el presente trabajo. -Reducción del daño y la muerte celular frente a la radiación UVB en cultivos primarios de fibroblastos humanos tratados con la combinación de los extractos naturales (clorofila A y morina) y m-ALA Con objeto de analizar el papel protector de la combinación de los extractos naturales (clorofila A y morina) , junto con el precursor del fotosensibilizador endógeno PPIX (m-ALA) , frente a la radiación UVB, cultivos celulares de fibroblastos primarios humanos fueron incubados con los distintos tratamientos descritos en el apartado 3.4 de materiales y métodos, y se sometieron a irradiación con UVB. Transcurridas 24 y 48 horas los cultivos fueron fijados y teñidos con cristal violeta. La viabilidad celular fue cuantificada mediante absorbancia a 620 nm, y representada en porcentaje, asumiendo un 100% de viabilidad en la condición Control. La Figura 4 muestra que, con el tratamiento con los extractos naturales, así como con la combinación de los mismos con el precursor de la protoporfirina IX aumenta la viabilidad celular con respecto a las células únicamente rradiadas con luz UVB a las 24 horas tras el tratamiento, siendo dicho aumento significativo a las 48 horas tras el mismo. Con objeto de confirmar los resultados de viabilidad celular, transcurridas 24 y 48 h de los tratamientos, se llevó a cabo el análisis de ciclo celular mediante citometría de flujo, empleando yoduro de propidio, que penetra en la membrana de las células deterioradas para intercalarse entre las dos cadenas de ADN, tiñendo las células que han sufrido muerte celular. La Figura 5 muestra que, tal y como se esperaba en base al resultado anterior, se produce un incremento significativo de la muerte celular en las células únicamente irradiadas con luz UVB tanto a las 24 como a las 48h tras la irradiación de las mismas, descendiendo dicha muerte levemente en presencia de la combinación de clorofila a y morina 48h el tratamiento. Sin embargo, tal y como estaba previsto, el tratamiento completo lleva a una drástica reducción de la muerte celular en respuesta a la irradiación con UVB, tanto a 24 como a 48h, registrándose unos niveles de muerte similares a las células control, y demostrándose un claro efecto protector del tratamiento completo frente al daño producido por la irradiación con UVB. De manera paralela, y para corroborar estos resultados, se tomaron imágenes de campo claro de los cultivos, empleando para ello un microscopio invertido, de manera frecuente hasta que las células control llegaron a confluencia (48h) . La Figura 6 muestra que, tal y como se esperaba en base a los resultados anteriores, 24 horas tras la irradiación de los cultivos celulares con luz UVB, se observaba muerte celular, manifestada principalmente como debris celular en el sobrenadante y siendo prácticamente total 48 horas tras la misma. Asimismo, se observa una disminución parcial de dicha muerte celular en las células tratadas con los extractos naturales, siendo ésta más notoria en el caso del tratamiento combinado de los extractos naturales con el precursor de la PpIX (mALA) tanto a las 24 como a las 48 horas tras los tratamientos. A continuación, para corroborar la reducción de la muerte celular observada y determinar el potencial papel protector del tratamiento completo frente al daño causado por el UVB en los cultivos primarios de fibroblastos humanos, se llevó a cabo la inmunodetección de la histona de daño yH2AX en las diferentes condiciones estudiadas. Como muestra la Figura 7, el control (sin irradiar y sin tratamiento) no muestra expresión de la histona yH2AX en ninguno de los tiempos estudiados. Sin embargo, la irradiación con luz UVB, tal y como está descrito, induce la expresión de la histona de año yH2AX, disminuyendo notoriamente en las células tratadas con la combinación de clorofila a y morina, 48h tras la irradiación con UVB de las mismas. Sin embargo, tal y como se esperaba, las células tratadas con el tratamiento concomitante con morina, clorofila A y m-ALA, no mostraron expresión de yH2AX en respuesta a la radiación UVB, sugiriéndose un claro efecto protector de este tratamiento completo frente al daño causado por la irradiación con UVB. Finalmente, en base a los resultados obtenidos de la disminución en la expresión de la histona yH2AX tras la incubación de los cultivos primarios de fibroblastos humanos con el tratamiento combinado de los extractos naturales (con y sin m-ALA) , indicativo de disminución de daño celular, y a la disminución de la muerte celular observada, se analizó la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo celular en todas las condiciones analizadas ya que la liberación de la misma ocurre en el momento en el que se rompe la membrana plasmática durante la muerte celular (Celeste et al. 2010) . La determinación de la liberación de la LDH y el porcentaje de citotoxicidad se llevó a cabo mediante la cuantificación por colorimetría y posterior medición de la densidad óptica tal y como se describe en el apartado 3.9 de materiales y métodos. En base a esto, la Figura 8 muestra que la citotoxicidad asociada a la irradiación con UVB aumenta notablemente en comparación con el control, mientras que, en las muestras tratadas con clorofila A y morina, se produce una clara disminución de la citotoxicidad 24h tras el tratamiento e irradiación de las mismas con luz UVB. Dicho efecto protector se intensifica en células sometidas al tratamiento concomitante de los extractos naturales con m-ALA, 48h tras el tratamiento de los cultivos celular y la irradiación de los mismos con luz UVB. -Incremento de la Fase S y la proliferación celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos en respuesta al tratamiento completo con clorofila a, morina y m­ ALA como precursor de la PplX Teniendo en cuenta que para el tratamiento completo se emplea m-ALA que es incorporado en la ruta biosintética del grupo hemo, dando lugar a la formación del fotosensibilizador endógeno PplX, y que su irradiación con luz de longitud de onda adecuada (635 nm) conduce a la generación de dosis no letales de ROS, que inducen un incremento en la proliferación celular (Carrasco et al. 2016) , se planteó analizar si a través e la generación de una cadena de electrones desde la luz UVB (311 nm) y tras ser absorbida por los diferentes extractos vegetales, primero morina y después clorofila A, se estimularía el pico de absorción de la PpIX (635 nm) , la cual tras excitarse conduciría a la generación de una dosis transitoria y subletal de ROS. En este sentido, se quiso analizar si se estaba produciendo un potencial incremento de la fase S celular (síntesis de DNA) tras la irradiación con UVB en los cultivos primarios de fibroblastos humanos tras el tratamiento concomitante de los extractos vegetales con m-ALA. Así, los cultivos de fibroblastos primarios humanos fueron incubados con el tratamiento completo con clorofila A, morina y m-ALA durante 4 horas, siendo posteriormente irradiados con luz UVB. A las 24 y 48 horas tras el tratamiento, los pellets y sobrenadantes obtenidos fueron teñidos con yoduro de propidio y analizados mediante citometría de flujo. La Figura 9 muestra que, tal y como se esperaba, se produce un aumento de la fase S celular a las 24 y 48h tras el tratamiento de los cultivos celulares con clorofila A y morina con y sin m-ALA e irradiadas con luz UVB, siendo dicho aumento muy significativo 48 horas tras el tratamiento concomitante de los extractos vegetales con el m-ALA. Además, tal y como está descrito en la bibliografía, también se produce un incremento de la fase S en los cultivos celulares únicamente irradiados con UVB (Imray et al., 1983) siendo este mayor 24 horas tras la irradiación. Una vez determinado el incremento de la fase S en los cultivos celulares en respuesta al tratamiento, se quiso confirmar un aumento de la proliferación celular mediante el estudio de la expresión mediante inmunodetección del marcador de proliferación Ki67 en cultivos primarios de fibroblastos humanos. La Figura 10, muestra que, en concordancia con el resultado obtenido en el ensayo de citometría de flujo, la presencia del marcador de proliferación Ki67 aumenta en los fibroblastos incubados con el tratamiento completo que contiene m-ALA en comparación con las células únicamente irradiadas con luz UVB y manteniéndose similar al control (sin irradiar y sin tratamiento) en las células tratadas con clorofila a, morina sin m-ALA. Además, la presencia del marcador Ki67 disminuye en el cultivo de fibroblastos únicamente irradiados con luz UVB y no aumenta en los tratados con clorofila A y morina. -Incremento de los componentes de la matriz extracelular en cultivos primarios de fibroblastos humanos con el tratamiento completo que combina clorofila a y morina con m­ ALA como precursor de la protoporfirina IX Teniendo en cuenta que la radiación UVB induce daño en los fibroblastos dérmicos como consecuencia de la generación elevada de ROS, conduciendo a una disminución de la producción y remodelación de MEC relacionada con la disminución de colágeno (Rittie & Fisher, 2015; Mingwu et al., 2019; Tao et al., 2019) y que en ensayos previos del laboratorio no publicados se había determinado el aumento de las fibras de colágeno en la dermis de ratones jóvenes, como consecuencia de la proliferación de los fibroblastos tras la generación puntual y transitoria de niveles no letales de ROS mediante el TF, se quiso analizar si el tratamiento propuesto era eficaz en la prevención del daño del UVB sobre la destrucción de fibras colágenas y si además se estimulaba la producción de las mismas asociada al incremento de la proliferación de los fibroblastos. Para ello, se llevó a cabo una cuantificación de la concentración de colágeno Ia1 humano liberado al medio de cultivo 24h tras los tratamientos, analizado mediante ELISA (Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas) . En la Figura 11 se muestra una disminución de la deposición de Colágeno Ia1 en los fibroblastos irradiados con UVB en comparación con el control. Sin embargo, las células expuestas al tratamiento con clorofila A y morina irradiadas con luz UVB, mostraron una deposición similar a las células control, aumentando ligeramente la misma en los fibroblastos tratados con la combinación de clorofila a, morina y m-ALA 24h tras la administración de los tratamientos. Finalmente, para corroborar este resultado, se llevó a cabo la validación mediante PCR cuantitativa de varios marcadores de la matriz extracelular, como Colágeno III (Col IIIA1) , Colágeno II (Col IIA1) y Elastina (ELN) , a partir de ADNc obtenido de muestras de cultivos primarios de fibroblastos humanos expuestos a las diferentes condiciones establecidas 24 y 48 horas tras los tratamientos y la irradiación con luz UVB y normalizando su expresión al ARN ribosómico 18s. Los resultados obtenidos se recogen en la Figura 12, mostrándose un notorio incremento de la expresión de los marcadores de la matriz extracelular Col IIIA1, Col IIA1 y ELN en los fibroblastos humanos expuestos al tratamiento completo, respecto al control y al resto de las condiciones establecidas, corroborando un papel protector de la clorofila A y la morina frente al daño producido por la irradiación con luz UVB, así como un papel estimulador de la proliferación ante el tratamiento completo de los fibroblastos y la irradiación con luz UVB. DESCRPICIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. A) Representación esquemática del procedimiento de terapia fotodinámica, en la que se utilizan tres elementos, un agente fotosensible (PS) , luz de longitud de onda adecuada capaz de ser absorbida por el PS (flecha roja) y oxígeno molecular, para producir especies reactivas de oxígeno (Reactive Oxygen Species, ROS) . B) Ruta biosintética de producción del fotosensibilizador endógeno PpIX en la mitocondria. Figura 2. Representación esquemática del proceso de transferencia fotónica secuencial en la piel. Figura 3. El daño celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos tras su exposición a luz UVB comienza a manifestarse a las 24 horas tras la exposición. Inmunodetección mediante microscopia de fluorescencia del marcador de daño histona yH2AX (verde) a distintos tiempos establecidos (10 min, 30 min, 1 hora, 4 horas, 16 horas, 24 horas y 48 horas) en cultivo de fibroblastos humanos primarios. En azul se muestran los núcleos con contra-tinción con DAPI. Imágenes representativas de 3 réplicas experimentales. Barra de escala = 100 ^m. Figura 4. La viabilidad celular aumenta en cultivos primarios de fibroblastos humanos tratados con clorofila A, morina y el precursor de la protoporfirina IX (m-ALA) en comparación con las células únicamente irradiadas con luz UVB 24h tras el tratamiento, siendo dicho aumento significativo 48h tras el mismo. Cuantificación de la viabilidad celular mediante tinción con cristal violeta (absorbancia medida a 620 nm de longitud de onda) en cultivos primarios de fibroblastos humanos tras 24 horas a) y 48 h del tratamiento b) . *, significativo, p 0, 1. n=3. Las barras de error indican el error estándar. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de morina. Figura 5. Reducción drástica de la muerte celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos a las 48h tras la administración de la combinación de morina o cannabidiol (A) clorofila A (B) con y sin m-ALA) irradiadas con UVB, en comparación con células únicamente irradiadas con UVB. Cuantificación de la muerte celular medida mediante citometría de flujo en fibroblastos humanos teñidos previamente con yoduro de propidio y expresada en ratio con respecto al control (sin irradiar y sin tratamiento) . Las barras de error indican el error estándar. *, significativo, p 0, 1. n=3. Figura 6. El tratamiento completo con clorofila A, morina y m-ALA protege del daño producido en respuesta a la radiación UVB en cultivos primarios de fibroblastos humanos. Se muestran imágenes representativas de campo claro tomadas con microscopio invertido a las 24h (a) y 48h (b) tras la administración de los tratamientos. Imágenes representativas de 3 ensayos. Barra de escala = 100 ^m. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de morina. Figura 7. El daño celular causado por la radiación UVB disminuye notoriamente en presencia del tratamiento completo con clorofila A, morina y m-ALA en cultivos primarios de fibroblastos humanos. Se muestran imágenes representativas de microscopia de fluorescencia representativas de la inmunodetección del marcador de daño celular yH2AX (verde) a las 24h (a) y 48h (b) tras la realización de los tratamientos. En azul se muestra la contra-tinción de los núcleos con DAPI. Barra de escala = 100 ^m. Las imágenes son representativas de una n=3. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de morina. Figura 8. Disminución de la citotoxicidad asociada a la liberación de LDH como consecuencia del tratamiento completo combinado de morina o cannabidiol (A) clorofila A (B) y mALA (C) en cultivos primarios de fibroblastos humanos irradiados con UVB, 48h después. Cuantificación de la liberación de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH) al medio de cultivo celular 48h tras la administración de los tratamientos e irradiación de las células con luz UVB, expresada en porcentaje de citotoxicidad empleando la fórmula: % citotoxicidad = (tratamiento-control total) / (máxima liberación de LDH-control total) x 100. n=2. Figura 9. Aumento significativo de la fase S celular en cultivos primarios de fibroblastos humanos irradiados con luz UVB en presencia o no de la combinación de morina o cannabidiol (A) , clorofila A (B) con y sin mALA (C) con respecto al control (sin irradiar y sin tratamiento) . Cuantificación de la fase S celular relativizada con respecto al control 48h después de la administración de los tratamientos mediante la tinción de las células con yoduro de propidio, y su posterior análisis por citometría de flujo. Las barras de error indican el error estándar. *, significativo, p 0, 1. n=3. Figura 10. Aumenta la proliferación celular en cultivos de fibroblastos primarios en presencia del tratamiento completo con morina, clorofila A, morina y mALA. Inmunodetección mediante microscopía de fluorescencia del marcador de proliferación Ki67 en cultivos primarios de fibroblastos humanos 24h (a) y 48h (b) tras la administración de los tratamientos. Barra de escala =100 ^M. Las imágenes son representativas de 3 ensayos. Resultados equivalentes se obtuvieron utilizando cannabidiol en lugar de morina. Figura 11. Aumento de la concentración de Colágeno Ia1 Humano en cultivos primarios de fibroblastos humanos tratados con la combinación de morina, clorofila A, y mALA frente a la radiación con luz UVB. Cuantificación de la concentración de Colágeno Ia1 Humano liberado al medio de cultivo 24h tras los tratamientos, analizado mediante ELISA (Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas) . n=1. Figura 12. Incremento de marcadores de matriz extracelular en cultivos primarios de fibroblastos humanos 24h tras el tratamiento completo con morina o cannabidiol (A) , clorofila A (B) y mALA e irradiados con luz UVB frente al control y al resto de las condiciones establecidas. Cuantificación de la expresión de los genes de la matriz extracelular Colágeno IIA1 y Elastina mediante PCR cuantitativa. Se utilizó ARN ribosómico 18s como control endógeno. Las barras de error indican error estándar. *, p 0, 1; **, p 0, 05. n=3.

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En fecha 13/05/2022 se realizó Admisión a Trámite
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