Patente nacional por "El factor de splicing EIF4A3 cómo biomarcador en hepatocarcinoma"

Reivindicaciones:
+ ES-2958385_A11. Uso in vitro de los niveles de expresión de EIF4A3 como biomarcador para diagnosticar y/ o pronosticar carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma. 2. Método in vitro de obtención de datos útiles para diagnosticar y/o pronosticar carcinoma hepatocelular, que comprende: a) determinar la expresión de EIF4A3 en una muestra previamente aislada de un mamífero y b) comparar los valores de la expresión de EIF4A3 obtenidos en a) con una cantidad de referencia. 3. Método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar carcinoma hepatocelular que incluye los pasos (a) - (b) de la reivindicación anterior y que además comprende: c) asignar al individuo que presenta en un análisis los niveles de expresión de EIF4A3 sobreexpresados con respecto a los valores medios de un individuo normal, al grupo de pacientes que padece carcinoma hepatocelular. 4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, donde la muestra biológica se selecciona entre sangre, plasma, suero y orina. 5. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en el que dicho resultado se obtiene mediante: a) un método de generación de perfiles de miARNs, como un microarray, y/o b) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa) , tal como PCR en tiempo real; c) transferencia Northern y/o d) inmunoensayo. 6. Un kit que comprende los elementos necesarios para cuantificar en una muestra biológica obtenida del sujeto el nivel de expresión de EIF4A3. 7. El kit según la reivindicación anterior que además comprende medios para comparar el nivel de expresión de EIF4A3 con una muestra de referencia. 8. Uso del kit según las reivindicaciones 6 a 7 para diagnosticar y/o pronosticar carcinoma hepatocelular en un individuo. 9. Un programa de ordenador adaptado para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica el método según cualquiera las reivindicaciones 2 a 5. 10. Un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera las reivindicaciones 2 a 5. 11. Una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera las reivindicaciones 2 a 5.

Los productos y servicios protegidos por este registro son:
C12Q 1/6886 - G01N 33/574

Descripciones:
+ ES-2958385_A1 El factor de splicing EIF4A3 como biomarcador en hepatocarcinoma CAMPO DE LA TÉCNICA La presente invención se encuentra dentro del campo de la biología molecular y medicina, y se refiere a un factor de splicing denominado EIF4A3 y sus usos. En concreto, se refiere al uso de este factor de splicing para la obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico de pacientes con hepatocarcinoma. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de hígado representa una patología compleja y heterogénea que engloba varios tipos de tumores malignos con características y pronóstico desfavorables, incluido el carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC) (Sia, D. et al, 2017) , siendo el tipo de cáncer de hígado más frecuente, con un 80% de los casos, seguido del colangiocarcinoma intrahepático que representa el 15% de los casos (Petrick, J.L. et al.2016) . El HCC es uno de los cánceres con peor pronóstico y mayor incidencia y mortalidad en el mundo (Sung, H. et al. 2021) . A pesar de la intensa caracterización y las importantes mejoras logradas en esta patología tumoral debido a los resultados obtenidos por la investigación a lo largo de los años, las estrategias diagnósticas y terapéuticas en el HCC no son del todo efectivas. Por tanto, existe la necesidad de encontrar elementos o perfiles moleculares comunes que faciliten estrategias diagnósticas y terapéuticas integrales y eficaces, y que puedan mejorar el pronóstico en esta devastadora patología. En la actualidad, los análisis de diagnóstico para el HCC se implementan dentro de los programas de vigilancia, aunque tienen limitaciones notables y existe una necesidad urgente de pruebas más precisas. Las pruebas de diagnóstico radiográfico, específicamente la ecografía hepática, se han utilizado con frecuencia como prueba de vigilancia del HCC. Sin embargo, el rendimiento de la ecografía tiene limitaciones (Tzartzeva, K. et al., 2018) . Estos enfoques pueden complementarse con pruebas serológicas, donde la mejor estudiada y utilizada en la práctica clínica es la alfa-fetoproteína (AFP) . Sin embargo, la sensibilidad de la AFP para los tumores en estadio temprano es muy limitada, sólo del 32% al 49% (Kanwal, F. 2019) . Por ello, es necesario identificar biomarcadores más eficaces que los que se utilizan actualmente para la detección precoz del HCC y aumentar la vigilancia del HCC entre los pacientes en riesgo. En este sentido, características distintivas del cáncer parecen estar asociadas con alteraciones específicas en el proceso de splicing, que a su vez conduce a un fenotipo de cáncer más agresivo e invasivo (Sveen, A. et al. 2016) . Por tanto, el proceso de splicing ha surgido como una alternativa prometedora para la identificación de nuevos biomarcadores para el diagnóstico y pronóstico de diversas patologías metabólicas y numerosos tipos de cáncer, así como una posible fuente para la identificación de posibles dianas terapéuticas para el tratamiento del cáncer. El splicing es el proceso por el cual las regiones codificantes y no codificantes de un gen se reestructuran y reorganizan para generar una variedad de transcritos de ARN, lo que determina la aparición de diferentes variantes e isoformas de proteínas que, en muchos casos, ejercen funciones biológicas distintas e incluso opuestas. La alteración de la maquinaria que lo lleva a cabo puede promover la generación de variantes de splicing aberrantes, las cuales se han relacionado con el desarrollo y/o progresión de diversas enfermedades, entre las que se encuentra el cáncer. Un factor de splicing o factor de empalme es una proteína involucrada en la eliminación de intrones de las cadenas de ARN mensajero, para que los exones puedan unirse; el proceso tiene lugar en partículas conocidas como espliceosoma. EIF4A3 es una ARN helicasa dependiente de ATP, miembro de la familia de factores de iniciación de la transcripción EIF4A, que a su vez pertenece a la superfamilia de proteínas Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD) , familia "DEAD box" o caja DEAD. Los factores de iniciación de la transcripción EIF4A están involucrados en varios aspectos de la biología del ARN, desde la transcripción y traducción hasta la degradación del ARNm. En concreto, EIF4A3 está involucrada en el splicing de pre-ARNm como componente del espliceosoma. Se trata de un componente central del complejo de unión de exones multiproteína ("EJC" por sus siglas en inglés) . El EJC es una estructura dinámica que consta de proteínas centrales y varios factores citoplasmáticos, nucleares y periféricos asociados que se unen al complejo solo de manera transitoria durante el ensamblaje del EJC o durante el metabolismo posterior del ARNm. El núcleo del EJC consiste en cuatro proteínas, EIF4A3 (DDX48) , MAGOH, Y14 (RBM8A) y Barentsz (BTZ, también llamada CASC3 o MLN51) , que se unen de manera estable al ARNm generado tras el proceso de splicing, muy cerca de las uniones exón-exón. El EJC marca la posición de la unión exón-exón en el ARNm maduro para la maquinaria de expresión génica y los componentes centrales permanecen unidos a los ARNm en todas las etapas del metabolismo del ARNm, lo que influye en los procesos posteriores, incluida la exportación de ARNm nuclear, la localización del ARNm subcelular y la eficiencia de la raducción y degradación del ARNm mediada por mutaciones terminadoras ("NMD -Nonsense Mediated Decay) . DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En particular, los autores de la presente invención han observado que EIF4A3 se encuentra sobreexpresado en HCC con respecto a tejido sano en varias cohortes de pacientes con HCC. Además, la expresión (ARNm y proteína) se asoció con parámetros clínicos, mutacionales y con alta sensibilidad discriminatoria. Los resultados demuestran también que los niveles plasmáticos y de orina de EIF4A3 están significativamente elevados en pacientes con HCC y que pueden discernir entre pacientes con HCC y controles (individuos sanos) con una alta especificidad y sensibilidad (AUC de las curvas ROC de 86, 25% y 100 %, respectivamente) , lo que demuestra su condición como posible herramienta diagnóstica y/o pronóstica útil en clínica. Los autores de la presente invención han estudiado la posible desregulación y las implicaciones patológicas funcionales de EIF4A3 en el carcinoma hepatocelular (HCC) . Los inventores observaron que la expresión de EIF4A3 estaba consistentemente elevada (ARNm) en HCC frente a tejidos control en todas las cohortes estudiadas (Figura 1) . La expresión de EIF4A3 obtuvo altos porcentajes de sensibilidad y especificidad en curva ROC (Figura 2) . Además, la expresión de EIF4A3 se asoció con características histológicas de agresividad tumoral, con una disminución de la supervivencia general y aumento de la recurrencia (Figura 4A y 4B) , y se asoció con mayor presencia de mutaciones en genes claves en HCC (Figura 3F) . Por último, se analizaron muestras de plasma y orina (Figura 5) de una cohorte prospectiva de pacientes con HCC para determinar los niveles de EIF4A3 en comparación con los niveles de EIF4A3 en plasma y orina de pacientes controles (pacientes sanos) . Se observó un área bajo la curva de los niveles de EIF4A3 en HCC de 86, 25% en plasma y del 100% en orina, con respecto a los pacientes controles. En resumen, EIF4A3 se sobreexpresa en HCC, y la presencia en plasma y orina de este factor representa una nueva estrategia diagnóstica. Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso in vitro de los niveles de expresión de EIF4A3 como biomarcador de carcinoma hepatocelular. En esta memoria se entiende por EIF4A3 o factor de iniciación de la transcripción eucariota 4A3, también denominado Fal1; RCPS; DDX48; MUK34; NUK34; NMP265; eIF4AIII; eIF4A-III; eIF-4A-NI, a un gen que codifica un miembro de la familia de proteínas "DEAD boX o caja DEAD. Las proteínas de caja DEAD, caracterizadas por el motivo conservado Asp-Glu-Ala-Asp (DEAD) , son helicasas de ARN putativas. Están implicadas en una serie de procesos celulares que implican la alteración de la estructura secundaria del ARN, como el inicio de la traducción, el empalme nuclear y mitocondrial y el ensamblaje de ribosomas y espliceosomas. Según sus patrones de distribución, se cree que algunos miembros de esta familia están involucrados en la embriogénesis, la espermatogénesis y el crecimiento y división celular. La proteína codificada por este gen es una proteína de matriz nuclear. Su secuencia de aminoácidos es muy similar a las secuencias de aminoácidos de los factores de iniciación de la traducción eIF4AI y eIF4AII, otros dos miembros de la familia de proteínas "DEAD box". En el contexto de la presente invención, EIF4A3 se define también por una secuencia de nucleótidos o polinucleótido, que constituye la secuencia codificante de la proteína EIF4A3, y que comprendería diversas variantes procedentes de: a) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID NO: 1, b) moléculas de ácido nucleico cuya cadena complementaria híbrida con la secuencia polinucleotídica de a) , c) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de a) y/o b) debido a la degeneración del código genético, d) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica con una identidad de al menos un 80%, un 90%, un 95%, un 98% o un 99% con la SEQ ID NO: 1. en las que el polipéptido codificado por dichos ácidos nucleicos posee la actividad y las características estructurales de la proteína EIF4A3. Preferiblemente, es la SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 2 Método de diagnóstico de la invención. Las enfermedades en las que la alteración de la actividad de EIF4A3 puede ser diagnóstica, y en concreto carcinoma hepatocelular, pueden ser detectadas midiendo la cantidad de ácidos nucleicos (ADN y/o ARN y/o ARNm) que codifican para EIF4A3, o la cantidad de proteína EIF4A3 que se expresa, en comparación con células normales. La detección de los oligonucleótidos puede hacerse por métodos bien conocidos en el estado de la técnica (como por ejemplo, pero sin limitarse, sondas con nucleótidos marcados, hibridación ADN-ADN ó ADN-ARN, amplificación por PCR empleando nucleótidos marcados, la RT-PCR) . Procedimientos para detectar la expresión de la proteína EIF4A3 también son bien conocidos en el estado de la técnica, como por ejemplo anticuerpos poli o monoclonales, ELISA, radioinmunoensayo (RIA) , y FACS (fluorescence activated cell sorting) . Por tanto, en otro aspecto de la invención se describe un método in vitro para la obtención de datos útiles en el diagnóstico y/o pronóstico del carcinoma hepatocelular, que comprende: a) determinar la expresión de EIF4A3 en una muestra previamente aislada de un mamífero, b) comparar los valores de la expresión de EIF4A3 obtenidos en a) con una cantidad de referencia. Otro aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar y/o pronosticar carcinoma hepatocelular, de ahora en adelante segundo método de la nvención, que comprende los pasos (a) - (b) según el primer método de la invención, y además comprende: c) asignar al individuo que presenta los niveles de expresión de EIF4A3 sobreexpresados, con respecto a los valores medios de un individuo normal, al grupo de pacientes con carcinoma hepatocelular. Una "muestra biológica" tal como se define aquí, es una pequeña parte de un sujeto, representativa del conjunto. En una realización preferida de este aspecto de la invención, la muestra biológica se selecciona de entre sangre, plasma, suero y orina. El primer método de la invención implica la comparación de los niveles de expresión de EIF4A3 con los niveles de EIF4A3 de una muestra de referencia o con un valor mediano. En el contexto de la presente invención, se entiende por "muestra de referencia" la muestra que se usa para determinar la variación de los niveles de expresión de EIF4A3 de la presente invención. En una realización preferida, el valor de referencia se obtiene de los valores de expresión obtenidos de una muestra con individuos que no tienen carcinoma hepatocelular. Preferiblemente, se toman muestras de referencia de varios individuos que no tienen carcinoma hepatocelular y se combinan, de modo que el valor de referencia refleje el valor medio de dichas moléculas en la población de individuos que no padecen carcinoma hepatocelular. "Valor de referencia" es el nivel de expresión de EIF4A3 en una muestra de referencia. La detección la cantidad de producto de expresión de EIF4A3, puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Los niveles de expresión van a dar un determinado perfil. El término "nivel de expresión", también denominado "cantidad producto" o "cantidad de producto de expresión" se refiere al material bioquímico, en concreto miARN. La medida de la cantidad o la concentración de producto de expresión preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión, está correlacionada directamente con el número de moléculas de ARN. Dicha señal (a la que también podemos referirnos como señal de intensidad) puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiqueta" o productos de reacción enzimática) . El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los productos de expresión, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento. El término "comparación", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la comparación de la cantidad del productos de expresión de EIF4A3 de la muestra biológica a analizar, también llamada muestra biológica problema, con una cantidad de los productos de expresión de EIF4A3 de una o varias muestras de referencia deseable. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. El cálculo descrito en el apartado (b) del método de la presente invención puede ser realizado manualmente o asistido por ordenador. En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el resultado se puede obtener mediante cualquiera de las siguientes técnicas: (i) un método de generación de perfiles de ARN, como un microarray, y/o (ii) un método que comprende PCR (reacción en cadena de la polimerasa) , tal como PCR en tiempo real; y/o (iii) transferencia Northern, y/o (iv) inmunoensayo. En la invención, el método para determinar el resultado, es decir, el nivel de expresión de EIF4A3, no necesita estar particularmente limitado. La PCR (reacción en cadena de la polimerasa) cuantitativa en tiempo real (generalmente abreviada como RQ-PCR, RT-qPCR, rt-PCR o qPCR) es una técnica de cuantificación de la expresión de ARNms sensible y reproducible que se puede usar particularmente para perfilar la expresión de ARNm en células y tejidos. Se puede utilizar cualquier método para evaluar los resultados de la RT-PCR, y se puede preferir el método ACt y el método AACt. El método AACt se describe en detalle por Livak et al. (Methods 2001, 25: 402-408) . (Ct = Valores umbral de ciclo) . Al poner en práctica la presente invención, el método AACt escrito por Livak et al. (Methods 2001, 25: 402-408) se utilizarán preferentemente. El AACtmethod incluirá una 'muestra de control' y una 'muestra de sujeto'. La 'muestra de sujeto' es una muestra del sujeto a analizar. Típicamente, se utilizan varias réplicas para cada concentración diluida para derivar la eficiencia de amplificación. La eficiencia de la amplificación por PCR se puede definir como porcentaje de amplificación (de 0 a 1) . Durante la reacción de qPCR, un software mide típicamente para cada muestra el número de ciclo en el que la fluorescencia (indicador de amplificación por PCR) cruza una línea arbitraria, el umbral. Este punto de cruce es el valor Ct. Una micromatriz es una matriz sobre un sustrato sólido (generalmente una lámina de vidrio o una célula de película delgada de silicio) que analiza grandes cantidades de material biológico, en el presente caso una gran cantidad de ARNm o, preferiblemente, sus transcritos de ADN inversos, que son detectables mediante sondas específicas inmovilizadas sobre el sustrato sólido. Una transferencia Northern implica el uso de electroforesis para separar muestras de ARN por tamaño y detección posterior con una sonda de hibridación complementaria a (parte de) la secuencia diana del ARN de interés. El término "inmunoensayo", tal y como se utiliza en la presente descripción se refiere a cualquier técnica analítica que se basa en la reacción de la conjugación de un anticuerpo con un antígeno. Ejemplos de inmunoensayos conocidos en el estado de la técnica son, por ejemplo, pero sin limitarse: inmunoblot, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) , inmunoensayo lineal (LIA) , radioinmunoensayo (RIA) , inmunofluoresecencia, x-map o chips de proteína. En otra realización preferida, el inmunoensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas o ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) . El ELISA se basa en la premisa de que un inmunorreactivo (antígeno o anticuerpo) puede ser inmovilizado en un soporte sólido, poniendo luego ese sistema en contacto con una fase fluida que contiene el reactivo complementario que puede unirse a un compuesto marcador. Existen diferentes tipos de ELISA: ELISA directo, ELISA indirecto o ELISA sándwich. El término "compuesto marcador", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a un compuesto capaz de dar lugar a una señal cromogénica, fluorogénica, radiactiva y/o quimioluminiscente que permita la detección y cuantificación de la cantidad de anticuerpos frente a EIF4A3. El compuesto marcador se selecciona de la lista que comprende radioisótopos, enzimas, fluoroforos o cualquier molécula susceptible de ser conjugada con otra molécula o detectada y/o cuantificada de forma directa. Este compuesto marcador puede unirse al anticuerpo irectamente, o a través de otro compuesto. Algunos ejemplos de compuestos marcadores que se unen directamente son, pero sin limitarse, enzimas como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa, isótopos radiactivos como 32P o 35S, fluorocromos como fluoresceína o partículas metálicas, para su detección directa mediante colorimetría, auto-radiografía, fluorimetría, o metalografía respectivamente. El método de la presente invención se puede aplicar con muestras de individuos de cualquier sexo, es decir, hombres o mujeres, y a cualquier edad. En el método de la presente invención, la expresión del ARNm puede normalizarse, preferiblemente en relación con la expresión de otra molécula de ARN. Existen métodos de normalización bien conocidos en el estado de la técnica. La invención proporciona un método para asignar a un sujeto humano en uno de los dos grupos: el grupo, que comprende sujetos identificables por el método de la invención y el grupo 2, que representa los sujetos restantes. Una "muestra de referencia", como se usa aquí, significa una muestra obtenida de un grupo de sujetos sanos que no tiene un estado de enfermedad o fenotipo particular. Los niveles de referencia pueden ser determinada mediante la medición de los niveles de expresión, y esos niveles de referencia se puede ajustar a las poblaciones específicas (por ejemplo, un nivel de referencia puede estar relacionada con la edad, por lo que las comparaciones se puede hacer entre los niveles de expresión en las muestras de los sujetos de una cierta edad y niveles de referencia para una enfermedad particular, el fenotipo, o falta de ella en un determinado grupo de edad) . En una realización preferida, la muestra de referencia se obtiene de varios sujetos en general, o de sujetos que no padecen carcinoma hepatocelular. El experto en la técnica apreciará que el tipo de muestra de referencia puede variar dependiendo del método específico a realizar. El perfil de expresión en la muestra de referencia de preferencia puede ser generado a partir de una población de dos o más personas. La población, por ejemplo, pueden contener 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más personas. Una vez que los niveles de expresión en relación con los valores de referencia se han determinado, es necesario identificar si existen alteraciones en la expresión (aumento o disminución de la expresión) . La expresión (y los niveles del producto de expresión del gen) e considera aumentada en una muestra de la materia objeto de estudio cuando los niveles de incremento con respecto a la muestra de referencia son al menos de un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, al menos un 25%, por lo menos 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%, por menos por lo menos 65%, por lo menos el 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100%, por lo menos 110 %, por lo menos 120%, por lo menos 130%, por lo menos 140%, por lo menos 150%, o más. Del mismo modo, la expresión se considerada disminuida cuando sus niveles disminuyen con respecto a la muestra de referencia en al menos un 5%, por lo menos 10%, por lo menos 15%, por lo menos el 20%, por lo menos el 25%, al menos un 30%, por lo menos el 35%, por lo menos el 40%, por lo menos 45%, por lo menos el 50%, por lo menos el 55%, por lo menos el 60%) , por lo menos el 65%, por lo menos 70%, por lo menos el 75%, por lo menos el 80%, por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos 100% (es decir, ausente) . Kit o composición de la invención y usos. Otro aspecto de la invención se refiere a un kit o dispositivo, de ahora en adelante kit o dispositivo de la invención, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el nivel de expresión de EIF4A3. En una realización preferida el kit o dispositivo de la invención comprende: (a) medios para detectar en una muestra biológica obtenida del sujeto los niveles de expresión de los biomarcadores de la invención, (b) medios para comparar el nivel de expresión de los biomarcadores determinados en (a) con una muestra de referencia, En una realización preferida el kit o dispositivo que comprende al menos uno o más oligonucleótidos capaces de hibridar con EIF4A3. Se prefiere que dicho oligonucleótido (s) sea capaz de hacerlo en condiciones de astringencia. En una realización preferida, uno o más de dichos uno o más oligonucleótidos (preferiblemente DNA) se definen adicionalmente mediante las siguientes sondas o primers: hsa-miRXX-miRCURY LNA miARN medidos con syber, cebadores específicos LNA ™ PCR. La astringencia es un término usado en experimentos de hibridación. La astringencia refleja el grado de complementariedad entre el oligonucleótido y el ácido nucleico; cuanto mayor ea la astringencia, mayor porcentaje de homología entre la sonda y el ácido nucleico unido al filtro. El experto en la materia sabe bien que la temperatura y las concentraciones de sal tienen un efecto directo sobre los resultados que se obtienen. Se reconoce que los resultados de la hibridación están relacionados con el número de grados por debajo de la Tm (temperatura de fusión) del ADN en el que se realiza el experimento. A menudo, las condiciones rigurosas se definen como un lavado con 0.1X SSC (solución salina-citrato de sodio (SSC) tampón a 65 °C. (SSC se proporciona generalmente como una solución madre 20X, que consiste en cloruro de sodio 3 M y citrato de trisodio 300 mM (ajustado a pH 7, 0 con HCl) ) . En realizaciones particulares, el kit se selecciona de (a) un kit adecuado para PCR, (b) un kit adecuado para Northern Blot, (c) un kit adecuado para análisis de micromatrices y (d) un inmunoensayo. También se pueden combinar dos o más de estas realizaciones, de modo que el kit pueda comprender, por ejemplo, tanto (a) como (c) . El kit o dispositivo de la invención puede usarse y el uso no está particularmente limitado, aunque se prefiere el uso en el método de la invención en cualquiera de sus realizaciones. Automatización del método de la invención implementándolo en un programa de ordenador. Otro aspecto de la invención se refiere a un programa de ordenador que comprende instrucciones para realizar el procedimiento de acuerdo con cualquiera de los métodos de la invención. En particular, la invención abarca programas de ordenador dispuestos sobre o dentro de una portadora. La portadora puede ser cualquier entidad o dispositivo capaz de soportar el programa. Cuando el programa va incorporado en una señal que puede ser transportada directamente por un cable u otro dispositivo o medio, la portadora puede estar constituida por dicho cable u otro dispositivo o medio. Como variante, la portadora podría ser un circuito integrado en el que va incluido el programa y que se haya adaptado para ejecutar, o para ser utilizado en la ejecución de los procesos correspondientes. Por ejemplo, los programas podrían estar incorporados en un medio de almacenamiento, como una memoria ROM, una memoria CD ROM o una memoria ROM de semiconductor, una memoria USB, o un soporte de grabación magnética, por ejemplo, un disco flexible o un disco duro. Alternativamente, los programas podrían estar soportados en una señal portadora transmisible; por ejemplo, podría tratarse de una señal eléctrica u óptica que odría transportarse a través de cable eléctrico u óptico, por radio o por cualesquiera otros medios. La invención se extiende también a programas de ordenador adaptados para que cualquier medio de procesamiento pueda llevar a la práctica los métodos de la invención. Tales programas pueden tener la forma de código fuente, código objeto, una fuente intermedia de código y código objeto, por ejemplo, como en forma parcialmente compilada, o en cualquier otra forma adecuada para uso en la puesta en práctica de los procesos según la invención. Los programas de ordenador también abarcan aplicaciones en la nube basadas en dicho procedimiento. Otros aspectos de la invención se refieren al medio de almacenamiento legible y a la señal transmisible que comprende instrucciones de programa necesarias para la ejecución del método de invención por un ordenador. Por tanto, otro aspecto de la invención se refiere a un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos de cualquiera de los métodos de la invención. A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Niveles de expresión de EIF4A3 (ARNm) en muestras de HCC frente a normales o tejido no tumoral adyacente al tumor (NTAT) de 7 cohortes diferentes: (A) Cohorte retrospectiva 1 (n = 154; de los cuales NTAT = 87 y Tumor = 87) ; (B) Cohorte retrospectiva 2 (n = 172; de los cuales Normal = 5, Cirrosis = 4, NTAT = 47 y Tumor = 57) ; y cinco in silico: (C) Wurmbach (n = 45; de los cuales Normal = 10 y Tumor = 35) ; (D) Roessler (n = 43; de los cuales Normal = 21 y Tumor = 22) ; (E) Roessler 2 (n = 445; de los cuales Normal = 220 y Tumor = 225) ; (F) TCGA (n = 369, de los cuales Normal = 50 y Tumor = 369) , y (G) Mas (n = 57, de los cuales Normal = 19 y Tumor = 38) . En A y B los resultados están ajustados por factor de normalización (NF) NF; en C los resultados están ajustados por el método de análisis de microarrays GC base pairs RMA - GCRMA; en D, E, F y G los resultados ajustados por Robust Multi - array Average - RMA. Los asteriscos (* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001; **** p <0.0001) indican diferencias estadísticamente significativas. Figura 2. Análisis de la curva ROC para discriminar entre HCC frente a normal o NTAT según la expresión de EIF4A3; realizado sobre las cohortes retrospectiva 1; Roessler, Roessler 2, Mas y TCGA, con resultado estadísticamente significativas para todas ellas. AUC; área bajo curva. Figura 3. (A) Asociación entre los niveles de expresión de EIF43, ajustados por NF, y el grado de diferenciación de los tumores (bien diferenciado, moderadamente diferenciado y poco diferenciado) en la cohorte Retrospectiva-1. Los asteriscos (* p <0.05; ** p <0.01; **** p <0.0001) indican diferencias estadísticamente significativas. WT significa tejido sin mutación y M tejido con mutación. (B) Asociación entre los niveles de expresión de EIF43, ajustados por NF, y el diámetro de los tumores (cm) en la cohorte Retrospectiva-1. (C) Supervivencia general de los pacientes de la cohorte Retrospectiva-1, categorizados por los niveles de expresión de ARNm de EIF4A3 en grupo de pacientes con bajo nivel de expresión de EIF4A3 (n = 38) y con alto nivel de expresión (n = 35) ; pacientes con la expresión más alta frente al grupo de expresión más baja (cut-off = mediana) , determinada por el método de long-rank p-value. (D) Supervivencia general de los pacientes de la cohorte TCGA categorizados por los niveles de expresión de ARNm de EIF4A3 en grupo de pacientes con bajo nivel de expresión (n = 182) y con alto nivel de expresión (n = 182) ; pacientes con la expresión más alta frente al grupo de expresión más baja (cut-off = mediana) , determinada por el método de long-rank p-value. (E) Recurrencia de pacientes de la cohorte Retrospectiva 1, pacientes con niveles de expresión de ARNm de EIF4A3 más altos (n = 19) frente al grupo de expresión más baja (n = 77) determinada por el método de long-rank p-value. (F) Niveles de expresión de EIF4A3 en pacientes TCGA con mutaciones en genes clave de HCC. Figura 4. (A) Supervivencia general y (B) Recurrencia de los pacientes de la cohorte CPTAC categorizados por los niveles de proteína de EIF3A3 en grupo con alta expresión (n = 75) y baja expresión (n = 76) , categorizados como pacientes con la expresión más alta frente al grupo de expresión más baja (punto de corte = mediana) determinado por el método de long-rank p-value. (C) Niveles de proteína EIF4A3, como Log2, en la cohorte CPTAC en NTAT (n = 165) y Tumor (n = 165) . (D) Asociación entre los niveles de proteína EIF4A3 y el número de tumores, (E) los niveles de AFP y (F) el tamaño del tumor en la cohorte CPTAC. Los asteriscos (* p <0.05; ** p <0.01; **** p <0.0001) indican diferencias estadísticamente significativas. NTAT significa tejido adyacente no tumoral. Figura 5. Niveles de EIF4A3 (ARNm) en muestras de plasma (A) y orina (C) de pacientes con HCC y controles (individuos sanos) de la cohorte prospectiva 1. Análisis de la curva ROC para determinar la precisión de los niveles de EIF4A3 en plasma (B) y orina (D) , como prueba diagnóstica para discriminar entre pacientes con HCC y controles. Los asteriscos (** p <0.01; **** p <0.0001) indican diferencias estadísticamente significativas. EJEMPLOS DE LA INVENCIÓN El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital Universitario Reina Sofía, de acuerdo con las guías institucionales y de Buenas Prácticas Clínicas (Protocolo número PI17 / 02287) y cumpliendo con la declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes o sus familiares. Se incluyeron tres cohortes independientes de muestras de pacientes con HCC que se sometieron a resección quirúrgica o trasplante de hígado: 1) Retrospectiva-1: 172 muestras incluidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) que abarcan HCC emparejado y tejido adyacente no tumoral (NTAT) (n=86) , 2) Retrospectiva-2: muestras congeladas instantáneamente que comprenden tejido de HCC (n = 57) , NTAT (n = 47) , muestras de hígado cirrótico (n = 41) y muestras de hígado normal de autopsias (n = 5) , y Tabla 1. Parámetros demográficos y clínicos de los pacientes con HCC incluidos en las cohortes retrospectivas. 3) Prospectiva- 1: muestras de plasma y orina de pacientes con HCC (n = 10) y pacientes de control (n = 10) . Tabla 2. Parámetros clínicos de pacientes con HCC y control incluidos en la cohorte de biopsia líquida (prospectiva-1) . Todas estas muestras se obtuvieron del Biobanco de Andalucía (Nodo Córdoba) , se evaluaron mediante histología hepática y el diagnóstico fue confirmado por dos patólogos independientes con experiencia. Los datos clínicos de los pacientes se obtuvieron a partir de informes médicos electrónicos. Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) , un servidor web interactivo para analizar los datos de expresión de secuenciación de ARN de The Cáncer Genome Atlas Program - TCGA y los proyectos Genotype-Tissue Expression (GTEx) , se utilizó para analizar el nivel de expresión de todos los espliceosomas. componentes y factores de empalme incluidos en el estudio en tejidos tumorales y normales, y la supervivencia de los pacientes con HCC en la cohorte TCGA. Para analizar los niveles de expresión de todos los componentes del espliceosoma y factores de empalme incluidos aquí en otras cohortes de validación, se utilizó la base de datos de Oncomine, que incluye datos de diferentes cohortes de HCC: hígado de Wurmbach (10 hígado normal frente a 35 HCC) , hígado de Mas (19 hígado normal frente a 38 HCC) , hígado de Roessler (21 hígado normal frente a 22 HCC) e hígado de Roessler 2 (220 hígado normal frente a 225 HCC) . El portal del Cancer Institute Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium (CPTAC) se utilizó para obtener datos de estudios proteómicos en tumores emparejados y tejidos hepáticos adyacentes de 159 pacientes con HCC relacionado con el virus de la hepatitis B (VHB) . Aislamiento de ARN y retrotranscripción. El ARN total de los tejidos FFPE (Retrospectiva-1) se aisló usando el Kit de purificación FFPE de Maxwell (Promega) . El ARN total de los tejidos congelados (Retrospectiva-2) se aisló usando el Kit de ADN / ARN / Proteína AllPrep (Qiagen, Madrid, España) , y el ARN total de las líneas celulares se aisló usando Reactivo TRI (Sigma-Aldrich) . La extracción de ARN fue seguida por el tratamiento con DNasa. La cantidad y la pureza del ARN recuperado se determinaron usando el espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher) . El ARN (1 ^g) se transcribió inversamente usando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid (Thermo Fisher) . Análisis de expresión de ARN mediante un array dinámico de qPCR basado en microfluídica y qPCR convencional. Los niveles de expresión de ARN de EIF4A3 se determinaron mediante un array dinámico de qPCR basado en microfluidos en muestras de tejido y por qPCR convencional en líneas celulares y tumores xenoinjertos. La preamplificación, el tratamiento con exonucleasa y el array dinámico qPCR se implementaron utilizando el sistema Biomark siguiendo las instrucciones del fabricante (Fluidigm, San Francisco, CA) . La qPCR convencional se llevó a cabo utilizando el sistema Stratagene Mx3000p con el Brilliant III SYBR Green Master Mix (Stratagene, La Jolla, CA) . En el caso de muestras de tejido, el nivel de expresión de cada transcripción se ajustó mediante un factor de normalización obtenido a partir de los niveles de expresión de dos genes de limpieza (ACTB y GAPDH) utilizando Genorm 3.3. En el caso de los ensayos in vitro y el modelo preclínico in vivo, el nivel de expresión de cada transcripción se ajustó mediante la expresión de ACTB. En todos los casos, estos genes de limpieza exhibieron una expresión estable entre los grupos experimentales. Análisis de EIF4A3 por ELISA Se utilizó un ELISA comercial (MBS7234176; MyBioSource, San Diego, CA, EE. UU.) para determinar los niveles de EIF4A3 en plasma y orina de pacientes de la cohorte Prospectiva-1 siguiendo las instrucciones del fabricante. La sensibilidad de este ensayo es de 1, 0 g / ml. No se ha informado de reactividad cruzada significativa o interferencia entre EIF4A3 y análogos. Las muestras de orina y plasma donadas se almacenaron en alícuotas de 1, 5 ml a -80 ° C. Análisis in silico de la expresión de EIF4A3 en cohortes de HCC. Para analizar el nivel de expresión de EIF4A3 y las curvas de supervivencia en TCGA, se utilizó GEPIA2. Para analizar los niveles de expresión de EIF4A3 en otras cohortes in silico: hígado de Wurmbach (10 hígado normal frente a 35 HCC) , hígado de Mas (19 hígado normal frente a 38 HCC) , hígado de Roessler (21 hígado normal frente a 22 HCC) y hígado de Roessler 2 (220 hígado normal frente a 225 HCC) , se utilizó la base de datos Oncomine. Análisis estadístico. Los datos se expresan como media ± error estándar de la media (SEM) , como veces de cambio (log 2) o niveles relativos en comparación con los controles correspondientes (establecidos en 100%) . Se evaluó la heterogeneidad de varianza de los datos mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov y, en consecuencia, se implementaron pruebas paramétricas (t de Student) o no paramétricas (U de Mann-Whitney) . Se realizaron correlaciones bivariadas de Spearman o Pearson para variables cuantitativas según normalidad. Se estudió la relación significativa entre la expresión de ARNm categorizado y la supervivencia del paciente utilizando curvas de Kaplan-Meier y long-rank-p. El análisis estadístico de las curvas ROC de la expresión de ARNm de la cohorte Retrospectiva-1 se realizó utilizando Metaboanalyst 5.0. El análisis PLS-DA es un método estadístico similar al análisis de componentes principales que cambia la varianza máxima encontrada por un modelo de regresión lineal en una dimensión diferente que muestra los mejores elementos para discriminar entre diferentes grupos experimentales (NTAT y tumor) . Los valores de p nferiores a 0, 05 se consideraron estadísticamente significativos. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism 6.0 (La Jolla, CA, EE. UU.) . Ejemplo 1: Desregulación e implicaciones patológicas de EIF4A3 en el carcinoma hepatocelular. Se evaluó la expresión de EIF4A3 (ARN / proteína) y sus implicaciones clínicas en pacientes con HCC de dos cohortes retrospectivas (n = 154 y n = 172) y cinco in silico: TCGA (n = 369) , Wurmbach (n = 45) , Roessler (n = 43) , Roessler 2 (n = 445) y Mas (n = 57) a nivel de ARNm y una cohorte a nivel de proteína. Además, se evaluó la capacidad de EIF4A3 como herramienta diagnóstica útil en clínica en pacientes con HCC. EIF4A3 se sobreexpresa en HCC y tiene capacidad predictiva. EIF4A3 (ARNm) se sobreexpresó significativamente en todas las cohortes estudiadas (Figura 1) . El análisis ROC reveló una capacidad discriminatoria significativa de la expresión de EIF4A3 en 5 de las 7 cohortes con datos disponibles, con un AUC en el rango de 0, 655-0, 877 (Figura 2) . Asociación entre la expresión de EIF4A3 y parámetros clínicos. No se observaron diferencias en la expresión de EIF4A3 entre etiologías en las cohortes Retrospectiva-1 y Retrospectiva-2 (Tabla 1) . Los niveles de EIF4A3 se correlacionaron con características clínicas importantes como la diferenciación y el diámetro del tumor (Figuras 3A y 3B) . De acuerdo con eso, los niveles altos de EIF4A3 se asociaron con una menor supervivencia en las cohortes Retrospectiva-1 y TCGA (Figuras 3C y 3D) , así como con una mayor recurrencia en los pacientes con HCC de la cohorte Retrospectiva-1 (Figura 3E) . Los niveles de EIF4A3 fueron significativamente más altos en pacientes TCGA con mutaciones en genes clave de HCC como TP53, CTNNB1, RB1, AXIN2, CCNE1 o CCND1 (Figura 3F) . EIF4A3 se sobreexpresa en HCC a nivel de proteína. Se observaron niveles más altos de proteína de EIF4A3 en muestras de HCC de la cohorte CPTAC en comparación con NTAT (Figura 4C) , donde los niveles altos de EIF4A3 en muestras de HCC se asociaron con una menor supervivencia (Figura 4B) y una mayor recurrencia (Figura 4A) y se correlacionaron con el número de tumores (Figura 4D) , los niveles de alfa-fetoproteína (AFP) (Figura 4E) y el tamaño del tumor (Figura 4F) . Ejemplo 2: Niveles de EIF4A3 en muestras de plasma y orina de pacientes con HCC y controles (individuos sanos) . Para investigar la capacidad diagnóstica de los niveles de EIF4A3 en plasma y orina, evaluamos estos niveles en pacientes con HCC (cohorte prospectiva 1) (Tabla 2) . Los niveles de EIF4A3 (ARNm) en plasma y orina fueron significativamente más altos en pacientes con HCC en comparación con los controles (Figuras 5A y 5B) , exhibiendo curvas ROC significativas en ambos casos (Figuras 5C y 5D) . Referencias 1. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L. & Llovet, J. M. Liver Cancer Cell of Origin, Molecular Class, and Effects on Patient Prognosis. Gastroenterology 152, 745-761, doi:10.1053/j.gastro.2016.11.048 (2017) . 2. Petrick, J. L. et al. International trends in liver cancer incidence, overall and by histologic subtype, 1978-2007. Int J Cancer 139, 1534-1545, doi:10.1002/ijc.30211 (2016) . 3. Sung, H. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin, doi:10.3322/caac.21660 (2021) . 4. Sveen, A., Kilpinen, S., Ruusulehto, A., Lothe, R. A. & Skotheim, R. I. Aberrant RNA splicing in cancer; expression changes and driver mutations of splicing factor genes. Oncogene 35, 2413-2427, doi:10.1038/onc.2015.318 (2016) . 5. Tzartzeva, K. et al. Surveillance Imaging and Alpha Fetoprotein for Early Detection of Hepatocellular Carcinoma in Patients With Cirrhosis: A Meta-analysis. Gastroenterology 154, 1706-1718 e1701, doi:10.1053/j.gastro.2018.01.064 (2018) . 6 Kanwal, F. & Singal, A. G. Surveillance for Hepatocellular Carcinoma: Current Best Practice and Future Direction. Gastroenterology 157, 54-64, doi:10.1053/j.gastro.2019.02.049 (2019) .

Publicaciones:
ES2958385 (08/02/2024) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
Eventos:
En fecha 14/07/2022 se realizó Registro Instancia de Solicitud
En fecha 14/07/2022 se realizó Admisión a Trámite
En fecha 14/07/2022 se realizó 1001P_Comunicación Admisión a Trámite
En fecha 28/07/2022 se realizó Suspenso en examen de oficio
En fecha 28/07/2022 se realizó 6101P_Notificación defectos en examen de oficio
En fecha 29/07/2022 se realizó 3007_Registro contestación al suspenso en examen de oficio
En fecha 01/08/2022 se realizó Superado examen de oficio
En fecha 03/08/2022 se realizó Publicación Defectos en examen de oficio
En fecha 19/05/2023 se realizó Realizado IET
En fecha 23/05/2023 se realizó 1109P_Comunicación Traslado del IET
En fecha 08/02/2024 se realizó Publicación Solicitud
En fecha 08/02/2024 se realizó Publicación Folleto Solicitud con IET (A1)
Pagos:
14/07/2022 - Pago Tasas IET