PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (LES) - Information sur le brevet

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+ ES-2644580_B2 ** (Ver fórmula) ** FIG. 1 ** (Ver fórmula) **

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G01G 3/13 - G01N 29/036 - G01N 33/53

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+ ES-2644580_B2 limitación se refiere a la baja sensibilidad que limita la determinación de las concentraciones extremadamente bajas de anticuerpos circulantes en suero. Por lo tanto, el desarrollo de biosensores de alta sensibilidad es de gran interés para determinar autoanticuerpos a concentraciones muy bajas. La técnica de microbalanza del cristal de cuarzo (Quartz Cr y stal Microbalances, QCM) se ha utilizado extensivamente como biosensor, gracias a su buen funcionamiento, alta sensibilidad y los bajos límites de detección, ofreciendo excelentes ventajas sobre las técnicas de detección tradicionales. En particular, la microbalanza del cristal de cuarzo con disipación (Quartz Cr y stal Microbalances with Dissipation, QCM-D) presenta grandes ventajas en relación a la sensibilidad. Además, QCM-D es atractiva debido a la respuesta del sensor en forma de variaciones en el factor de disipación (AD) que está relacionado con la viscoelasticidad, que a su vez se asocia a cambios estructurales de la película adherida sobre el transductor QCM-D. Esto añade información complementaria en relación con las interacciones estructurales entre sonda y objetivo, mostrando un alto potencial para diagnosticar y predecir enfermedades autoinmunes como el LES. Estos biosensores operan bajo el principio de que un cambio en la masa, resultante de la interacción entre el anticuerpo y su respectivo antígeno, puede ser determinado de manera directa. La patente US5501986A describe un método para detectar un analito (proteínas, hormonas, enzimas, anticuerpos, carbohidratos o ácidos nucleicos) en una muestra utilizando QCM, midiendo el cambio en la frecuencia de resonancia y correlacionando el cambio en la frecuencia con la cantidad de analito en la muestra. Sin embargo, sólo se relaciona la presencia de un analito con una única variable. Las medidas habituales de los experimentos piezoeléctricos corresponden a medidas de concentración superficial y tiempo de reacción, sin tener en cuenta las propiedades viscoelásticas de la capa adherida. Por ello, mediante esta metodología tradicional de medición no se pueden detectar estados de transición durante los procesos superficiales, al no poderse separar la señal monitorizada. Para solucionar este problema, se introdujo en los nuevos sensores piezoeléctricos la medida simultánea de la frecuencia de resonancia (f) (masa adherida) y el factor de disipación (D) (propiedades viscoelásticas). Con ello se pueden analizar los procesos interfaciales como una función de la naturaleza de su superficie. El gran problema de esta aproximación es que no introduce el tiempo de medida de una manera directa, por lo que no se puede medir in situ y además se hace complejo el análisis temporal del proceso monitorizado. Un ejemplo es la patente WO2008114003A1, que describe un método y aparato para detectar la presencia y/o cantidad de un analito oligomero (anticuerpo) en una muestra, mediante un biosensor piezoeléctrico en donde se establecen las relaciones entre distintas variables como la frecuencia de la resonancia y el factor de disipación. Esta invención está dirigida a la detección de ciertas enfermedades, en particular el Alzheimer. Recientemente se ha publicado en Biosensors & Bioelectronics 2017, 90, 166, el uso de una función (-df/dD) que permite introducir el factor tiempo dentro del estudio estructural de la interface monitorizada por QCM-D. Sin embargo, esta función presenta dos claras limitaciones: su interpretación implica a personal muy especializado y es poco sensible, por lo que presenta poca capacidad de discriminación. Descripción de la invención La presente invención resuelve los problemas existentes en el estado de la técnica mediante un procedimiento para el diagnóstico de enfermedades autoinmunes en un humano. Dicho procedimiento se basa en la medición en un resonador piezoeléctrico de la relación entre distintas variables como la concentración superficial y el factor de calidad, mediante la función dAr/dAQ, de un proceso interfacial de reconocimiento molecular antígeno-anticuerpo para el cribado de muestras de enfermos autoinmunes. La función dAr/dAQ monitoriza los cambios estructurales involucrados en el depósito de una especie reactiva sobre la superficie de un cristal piezoeléctrico. Ciertas aproximaciones son necesarias para la interpretación clara de su significado: La respuesta acústica de un sensor piezoeléctrico (de densidad "p0 ", espesor "h0 " y módulo de cizalladura elástica " p0 ") recubierto con una película viscoelástica (de densidad " p\ ", espesor " h1", viscosidad de deslizamiento % " y módulo de cizalladura elástica " m ") inmersa en un líquido Newtoniano (de viscosidad de deslizamiento " y profundidad de penetración viscosa "d3 ") es modelada mediante las siguientes expresiones: Ar» A^pQpo \_ 2f 2pph hh + h\pw - 2h\ d3 í V %A Vd3 J V\w2 m+w2% (1) AQ »-- Do % + 2h\ %'' 2pPo hoQo d 1 Vd3 J mw m+w % (2) donde "Q" es el factor de calidad, "D" el factor de disipación y f la frecuencia de resonancia del sensor piezoeléctrico (Figura 1). Si consideramos un film elástico puro (h ® 0) y consecuentemente: Ar DQ 2f 2ppoho + h1p1w Dn 2ppo h0Q0 i + 2h, í 3 ^
+ ES-2644580_A1 principal limitation se refiere a la baja sensibilidad que limita la determination de las concentraciones extremadamente bajas de anticuerpos circulantes en suero. Por lo tanto, el desarrollo de biosensores de alta sensibilidad es de gran interes para determinar autoanticuerpos a concentraciones muy bajas. La tecnica de microbalanza del cristal de cuarzo (Quartz Cr y stal Microbalances, QCM) se ha utilizado extensivamente como biosensor, gracias a su buen funcionamiento, alta sensibilidad y los bajos llmites de detection, ofreciendo excelentes ventajas sobre las tecnicas de deteccion tradicionales. En particular, la microbalanza del cristal de cuarzo con disipacion (Quartz Cr y stal Microbalances with Dissipation, QCM-D) presenta grandes ventajas en relation a la sensibilidad. Ademas, QCM-D es atractiva debido a la respuesta del sensor en forma de variaciones en el factor de disipacion (AD) que esta relacionado con la viscoelasticidad, que a su vez se asocia a cambios estructurales de la pellcula adherida sobre el transductor QCM-D. Esto anade information complementaria en relacion con las interacciones estructurales entre sonda y objetivo, mostrando un alto potencial para diagnosticar y predecir enfermedades autoinmunes como el LES. Estos biosensores operan bajo el principio de que un cambio en la masa, resultante de la interaction entre el anticuerpo y su respectivo antlgeno, puede ser determinado de manera directa. La patente US5501986A describe un metodo para detectar un analito (protelnas, hormonas, enzimas, anticuerpos, carbohidratos o acidos nucleicos) en una muestra utilizando QCM, midiendo el cambio en la frecuencia de resonancia y correlacionando el cambio en la frecuencia con la cantidad de analito en la muestra. Sin embargo, solo se relaciona la presencia de un analito con una unica variable. Las medidas habituales de los experimentos piezoelectricos corresponden a medidas de concentration superficial y tiempo de reaction, sin tener en cuenta las propiedades viscoelasticas de la capa adherida. Por ello, mediante esta metodologla tradicional de medicion no se pueden detectar estados de transition durante los procesos superficiales, al no poderse separar la senal monitorizada. Para solucionar este problema, se introdujo en los nuevos sensores piezoelectricos la medida simultanea de la frecuencia de resonancia (f) (masa adherida) y el factor de disipacion (D) (propiedades viscoelasticas). Con ello se pueden analizar los procesos interfaciales como una funcion de la naturaleza de su superficie. El gran problema de esta aproximacion es que no introduce el tiempo de medida de una manera directa, por lo que no se puede medir in situ y ademas se hace complejo el analisis temporal del proceso monitorizado. Un ejemplo es la patente WO2008114003A1, que describe un metodo y aparato para detectar la presencia y/o cantidad de un analito oligomero (anticuerpo) en una muestra, mediante un biosensor piezoelectrico en donde se establecen las relaciones entre distintas variables como la frecuencia de la resonancia y el factor de disipacion. Esta invention esta dirigida a la detection de ciertas enfermedades, en particular el Alzheimer. Recientemente se ha publicado en Biosensors & Bioelectronics 2017, 90, 166, el uso de una funcion (-df/dD) que permite introducir el factor tiempo dentro del estudio estructural de la interface monitorizada por QCM-D. Sin embargo, esta funcion presenta dos claras limitaciones: su interpretation implica a personal muy especializado y es poco sensible, por lo que presenta poca capacidad de discrimination. Description de la invencion La presente invencion resuelve los problemas existentes en el estado de la tecnica mediante un procedimiento para el diagnostico de enfermedades autoinmunes en un humano. Dicho procedimiento se basa en la medicion en un resonador piezoelectrico de la relation entre distintas variables como la concentration superficial y el factor de calidad, mediante la funcion dAr/dAQ, de un proceso interfacial de reconocimiento molecular antlgeno-anticuerpo para el cribado de muestras de enfermos autoinmunes. La funcion dAr/dAQ monitoriza los cambios estructurales involucrados en el deposito de una especie reactiva sobre la superficie de un cristal piezoelectrico. Ciertas aproximaciones son necesarias para la interpretacion clara de su significado: La respuesta acustica de un sensor piezoelectrico (de densidad " p0 ", espesor " h0 " y modulo de cizalladura elastica " p0 ") recubierto con una pellcula viscoelastica (de densidad " p ", espesor "h ", viscosidad de deslizamiento "% " y modulo de cizalladura elastica " px ") inmersa en un llquido Newtoniano (de viscosidad de deslizamiento "% " y profundidad de penetracion viscosa "£3 ") es modelada mediante las siguientes expresiones: Ar poAo 1 2/2 2^p0h0 ^ + l\PiW - 2hi d3 f V^3 J 2 2 Ai + w h AQ"o 2rfpo hoQo + 2h f \2 \S3 J PiW 2 2 Ai + w h (1) donde "Q" es el factor de calidad, "D" el factor de disipacion y "f" la frecuencia de resonancia del sensor piezoelectrico (Figura 1). Si consideramos un film elastico puro (y ^ 0) y consecuentemente: Aa/ PoMo AT 2f 2npoK Y + Kpw m3 AQ «-- Dn Y + 2h rd3Y V^3 y w Mi (3) (4) 2^fpo hoQo derivando ambas expresiones en funcion del tiempo de monitorizacion (t) se obtiene: dAT Ay]PoMo 1 d{h1p1w) w^cte dlPoMo w d{h1p1) dt 2fl 2Pho dt 2f2 2Pho dAQ Do 2 f Y ^ d f\w ^ w^cte wD0 dt 2rfPo hoQo VM3 y dt V M1 J 2rfPo hoQo - 2 dt C V VM3 y d_ dt vMi j (5) (6) y dividiendolas ( (dAT/dt) / (dAQ/dt) ) se obtiene la funcion dAT/dAQ (8) : dAT dAT _ dt Aa/ PoMo QoM d (h1P1) dt dAQ dAQ dt 2f Do 2 Y d dt f d ) M y AaI PoMo Qod d (hjPj) 2f Do2Y f h^ d \M1 j (7) Aa/ PoMo Qod32 2f Do2Y32 h d (P1 ) , _ d (h1) fu\+P1 fhd d h M1 J d VM1 j y h d`e AJ PoMo QoM dP1 " 2 f ^ d 2f Do2Y M1y dAT dAQ aa/PoMo Qo5l 2f Do2Y dP ** (Ver fórmula) ** A VM J (8) La ecuacion (8) muestra como la funcion dAT/dAQ es directamente proporcional a la variacion de la densidad de la pellcula adherida sobre la superficie sensora con respecto al 5 N° solicitud inverso de sus propiedades viscoelasticas. De esta manera, si la pellcula adherida a una superficie piezoelectrica es modificada unicamente por un proceso, el valor de la funcion dAr/dAQ permanecera constante con el tiempo de transformation, dado que la funcion: En ese caso, cada especie adherida modificara de una manera regular las propiedades viscoelasticas de la pellcula monitorizada por el sensor piezoelectrico. Sin embargo, si la transformacion monitorizada corresponde a multiples procesos paralelos, o consecutivos, la funcion dAr/dAQ variara con el tiempo presentando n-1 maximos, donde n corresponde al numero de especies constituidas durante el proceso de transformacion. Por lo tanto, dicha funcion permite caracterizar inequlvocamente los procesos de transformacion de las pellculas adheridas sobre materiales piezoelectricos, tanto por su evolution temporal como por los valores temporales que presenta. Por tanto, un primer aspecto de la invention es un procedimiento para el diagnostico de enfermedades autoinmunes en un humano que comprende dos etapas: (a) incubar una muestra obtenida de dicho humano en un resonador piezoelectrico que comprende un antlgeno proteico inmovilizado en la superficie del resonador y determinar el valor de la funcion dAr/dAQ descrita en la funcion (8) , y (b) realizar el diagnostico de enfermedades autoinmunes determinando el maximo del valor de dAr/dAQ, siendo positivo el diagnostico cuando el maximo es superior a un valor de corte de 600 ng/cm2. En otro aspecto de la invencion, las enfermedades autoinmunes para las cuales este procedimiento es adecuado incluyen al Slndrome de Sjogren (SS) , Lupus Eritematoso Sistemico (LES) y Lupus Eritematoso Neonatal (LEN). En otro aspecto de la invencion, el antlgeno proteico empleado para el diagnostico de las enfermedades anteriormente mencionadas es el antlgeno proteico Ro (anti-Ro). Especlficamente, el antlgeno proteico es Ro52 ya que los cambios conformacionales que implica su reconocimiento molecular son muy distintos entre pacientes y sujetos sanos. El lupus eritematoso sistemico (LES) es la enfermedad que mas se asocia con anti-Ro, con una positividad promedio reportada del 27.7%, que se incrementa hasta 45 a 50% cuando dp- ** (Ver fórmula) ** sera constante. se analiza por ELISA. En caso de un LE de inicio tardlo (mayor de 50 anos) la positividad es del 92%. Ademas, el anti-Ro es un importante marcador de enfermedad en el lupus eritematoso neonatal (LEN) , ya que mas del 90% de las madres y sus hijos lo expresan, aunque la prevalencia de LEN en madres anti-Ro es del 1%. Tambien el anti-Ro se encuentra presente en el 70 a 88% de los pacientes con Slndrome de Sjogren (SS) primario y del 10 al 50% de los casos secundarios. En otro aspecto de la invention, la muestra que se incuba en la etapa (a) del procedimiento se obtiene del suero sangulneo del paciente para el cual se quiere realizar el diagnostico de las enfermedades autoinmunes anteriormente citadas. Breve description de las figuras Figura 1. Representation de la geometrla de un cristal piezoelectrico cubierto por una pellcula viscoelastica (representacion general de un concepto conocido en el estado del arte). Figura 2. Representacion grafica de la funcion dAr/dAQ frente al tiempo durante la interaction de la protelna Ro52 con autoanticuerpos provenientes de pacientes autoinmunes anti-Ro+ (a) e individuos sanos (b). Descripcion de modos de realization Ejemplo 1. Estudio de la interaccion anticuerpo anti-Ro52/protelna Ro52. Se realizo una inmovilizacion qulmica de autoantlgenos especlficos en el resonador piezoelectrico y la determination de autoanticuerpos circulantes. La protelna Ro52 se inmovilizo mediante anclaje covalente, formando una monocapa autoensamblada. La monocapa fue creada sumergiendo la superficie piezoelectrica durante 16 h en una disolucion de acido mercaptopropionico 10 mM y posterior activation mediante EDC/NHS 10 mM durante 60 min. A continuation, la superficie se trato con carbohidrazida 5 mM durante 60 min. Despues, se dispensaron 100 pL de protelna Ro52 (33 mg/L) sobre la superficie sensora, incubandose durante 60 min. Finalmente, los residuos activos libres se bloquearon mediante el tratamiento de la superficie sensora con una disolucion acuosa conteniendo EDTA, BSA y Tween 20 al 0, 05%, pH 8, 5. Los anticuerpos fueron purificados a partir del suero de pacientes anti-Ro+. A continuation, se registro la variation de la concentration superficial y el factor de calidad durante la interaction selectiva de autoantlgenos con autoanticuerpos especlficos presentes en una disolucion de PBS1x, utilizando un sensor piezoelectrico. Posteriormente, se calculo la funcion dAr/dAQ, donde T" es la concentracion superficial y "Q" el factor de calidad, durante el proceso de reconocimiento molecular estudiado (Figura 2a). La Figura 2a muestra la huella dactilar caracterlstica del proceso de reconocimiento molecular, presentando un maximo en 3.000 ng/cm2 a los 1.000 segundos. De esta manera, de acuerdo con lo anteriormente descrito, esta funcion muestra que el proceso monitorizado corresponde a un enlace cooperativo. Los anticuerpos enlazan el antlgeno por medio de una interaccion especlfica epltopo-paratopo, para posteriormente ser reconocido el fragmento Fc de estos anticuerpos por medio del dominio PRY-SPRY de la protelna Ro52. Con este experimento se demuestra el uso de la funcion para monitorizar estados de transition y patrones de reconocimiento molecular, estableciendo caminos de reaction del proceso estudiado. Ejemplo 2. Estudio de la aplicacion de la funcion dAr/dAQ en pacientes sanos y pacientes autoinmunes anti-Ro+. Para demostrar la bondad del uso de la funcion dAr/dAQ para la discrimination de pacientes con enfermedades autoinmunes, se estudio el reconocimiento molecular de anticuerpos anti-Ro52 provenientes de pacientes autoinmunes anti-Ro+ y personas sanas. Como muestra la Figura 2, los anticuerpos de ambas poblaciones muestran un comportamiento de reconocimiento similar cuando este se representa frente al tiempo. El patron mostrado es una funcion con forma de pico que presenta un maximo alrededor de 1.000 segundos. Por lo tanto, ambos procesos presentan un mismo mecanismo de reaccion cooperativo. Sin embargo, los anticuerpos provenientes de pacientes anti-Ro+ presentan un maximo proximo a 3.000 ng/cm2. Este patron caracterlstico permanece inalterado cuando se analizan disoluciones que contienen anticuerpos anti-Ro52 de una poblacion de 130 pacientes autoinmunes anti-Ro+. En cambio, cuando se analiza el suero de pacientes sanos, el patron de reconocimiento de anticuerpos presenta un maximo en 500 ng/cm2. Por tanto, la funcion dAr/dAQ permite discriminar inequivocamente pacientes anti-Ro+, al 5 establecer un valor de corte en 600ng/cm2, identificando patrones de reconocimiento caracteristicos. 1. Procedimiento para el diagnostico de enfermedades autoinmunes en un humano, caracterizado por que comprende: (a) incubar una muestra obtenida de dicho humano en un resonador piezoelectrico que comprende un antlgeno proteico inmovilizado en la superficie del resonador y determinar el valor de la formula dAr dAQ Apodo QpSi 2f D02^23 dPi ** (Ver fórmula) ** W J respecto al tiempo, donde T" es la concentration superficial y "Q" el factor de calidad, "A" es area del resonador, "p0 " es la densidad", "D0" el factor de disipacion, f la frecuencia de resonancia y " /j0 " el modulo de cizalladura elastica del sensor piezoelectrico, " p " es la densidad" y "p1" es modulo de cizalladura elastica de una pellcula viscoelastica que recubre el sensor, " viscosidad de deslizamiento y "S3 " profundidad de penetracion viscosa de un llquido newtoniano en el cual se encuentra inmersa la pellcula, y (b) realizar el diagnostico de enfermedades autoinmunes determinando el maximo del valor de dAr/dAQ, siendo positivo el diagnostico cuando el maximo es superior a un valor de corte de 600 ng/cm2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado porque las enfermedades autoinmunes se seleccionan del grupo que consiste en Slndrome de Sjogren (SS) , Lupus Eritematoso Sistemico (LES) y Lupus Eritematoso Neonatal (LEN). 3. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que el antlgeno proteico es Ro (anti-Ro). 4. Procedimiento segun la reivindicacion 1 o 2, caracterizado por que el antlgeno proteico es Ro52 (anti-Ro52). 5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que dicha muestra es suero sangulneo.

Publications:
ES2644580 (29/11/2017) - A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica
ES2644580 (04/06/2018) - B2 Patente de invención con examen previo

Événements:
Au 26/07/2017, PETEX_Petición de examen sustantivo a été faite
Au 26/07/2017, Registro Instancia de Solicitud a été faite
Au 26/07/2017, Admisión a Trámite a été faite
Au 26/07/2017, Aceptación Tramitación CAP a été faite
Au 26/07/2017, 1001P_Comunicación Admisión a Trámite a été faite
Au 27/07/2017, Superado examen de oficio a été faite
Au 20/11/2017, Realizado IET a été faite
Au 22/11/2017, Informe Estado de la Tecnica a été faite
Au 22/11/2017, 1109P_Comunicación Traslado del IET a été faite
Au 29/11/2017, Publicación Solicitud con IET a été faite
Au 29/11/2017, Publicación folleto solicitud con IET (A1) a été faite
Au 09/02/2018, 5215P_Observaciones del solicitante al IET, Opinión Escrita y/o alegaciones a observaciones de terceros a été faite
Au 14/03/2018, Validación petición y/o pago de examen sustantivo conforme a été faite
Au 05/04/2018, Designación de comisión de expertos a été faite
Au 05/04/2018, Finalización de Examen Sustantivo a été faite
Au 05/04/2018, 6121P_Comunicación finalización de examen sustantivo a été faite
Au 12/04/2018, Publicación finalización de examen sustantivo a été faite
Au 28/05/2018, Concesión con examen sustantivo a été faite
Au 28/05/2018, Entrega título a été faite
Au 28/05/2018, 6125P_Notificación de concesión con examen sustantivo a été faite
Au 04/06/2018, Publicación concesión Patente a été faite
Au 04/06/2018, Publicación Folleto Concesión a été faite
Au 04/12/2018, Plazo expirado presentación de oposiciones contra la concesión de la Patente a été faite

Paiements:
26/07/2017 - Pago Tasas IET
06/08/2019 - Pago 03 Anualidad

Information sur l'enregistrement du brevet national par PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (LES) avec le numéro P201730972

L'enregistrement du brevet national par PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (LES) avec le numéro P201730972 a été demandé à la 26/07/2017. C'est un record dans Espagne, donc ce disque n'offre pas de protection dans le reste des pays. L'enregistrement PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (LES) avec le numéro P201730972 a été demandé par UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA par l'intermédiaire des services du Isabel Carvajal y Urquijo. L'enregistrement [modality] par PROCEDIMIENTO DE DIAGNÓSTICO DE LUPUS ERITEMATOSO SISTÉMICO (LES) avec le numéro P201730972 est classé comme G01G 3/13,G01N 29/036,G01N 33/53 selon la classification internationale des brevets.

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Inventions déposées en classe G01G

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